สรุป:

บทความนี้จะทบทวนปัจจัยสำคัญสองประการที่ต้องพิจารณาในกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์โปรตีน: ข้อกำหนดการใช้งานดาวน์สตรีมและลักษณะทางชีวภาพของโปรตีนเอง บทความเน้นว่าการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนคุณภาพสูงเป็นรากฐานสำหรับความน่าเชื่อถือและความสามารถในการทำซ้ำของข้อมูลการทดลองโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการผลิตโปรตีน recombinant สถานการณ์แอปพลิเคชันที่แตกต่างกันมีข้อกำหนดเฉพาะสำหรับความบริสุทธิ์ของโปรตีนกิจกรรมหรือปริมาณเอนโดท็อกซินและลักษณะของโปรตีนอาจส่งผลกระทบต่อกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์อย่างมีนัยสำคัญ ตามกรณีเฉพาะบทความแสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่ไม่ซ้ำกันควรนำรูปแบบการทำให้บริสุทธิ์ที่กำหนดเอง ในที่สุดกระบวนการผลิตโปรตีนอย่างเป็นระบบได้รับการเสนอ (รูปที่ 1) โดยเน้นการควบคุมคุณภาพเต็มรูปแบบจากการเลือกระบบการแสดงออกการออกแบบการก่อสร้างเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์และแนะนำการประเมินความเป็นเนื้อเดียวกันโปรตีนและการทำงานผ่านเทคนิคชีวฟิสิกส์ (เช่น Sec-Mals, DSF ฯลฯ ) บทความนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้คำแนะนำในทางปฏิบัติสำหรับนักวิจัยช่วยให้พวกเขากำหนดกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์ที่มีประสิทธิภาพและทำซ้ำได้ตามลักษณะและข้อกำหนดการประยุกต์ของโปรตีนเป้าหมายซึ่งจะช่วยเพิ่มคุณภาพและประสิทธิภาพของการวิจัยทางวิทยาศาสตร์

 

รูปที่ 1. แผนผังไดอะแกรมของกระบวนการผลิตโปรตีน

 

การผลิตโปรตีนที่มีความต้องการสูง - ตัวอย่างของการระบุปัญหาการออกแบบกลยุทธ์การบรรเทาผลกระทบและผลลัพธ์ที่สอดคล้องกัน

 

1. กรดนิวเคลียสผูกพันกับโปรตีน:

เมื่อบริสุทธิ์โปรตีนที่จับกับกรดนิวคลีอิกจำเป็นต้องมีหลายขั้นตอนในการกำจัดการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิก ในระหว่างการสลายนิวเคลียส (เช่น SM nuclease (Benzonase®) หรือ DNase หรือ RNase) จะต้องเพิ่ม แต่กรดนิวเคลียสที่ถูกผูกไว้ไม่สามารถลบออกได้อย่างสมบูรณ์ แทนที่ขั้นตอนการกำจัดกรดนิวคลีอิกเช่นการตกตะกอนของ PEI หรือ streptomycin ซัลเฟตการทำให้บริสุทธิ์เฮปารินหรือโครมาโตกราฟีแลกเปลี่ยนไอออน การปรากฏตัวของกรดนิวคลีอิกถูกตรวจสอบโดยอัตราส่วนของ A26 0 nm\/a28 0 nm ตลอดกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ หากอัตราส่วนต่ำกว่า 0.6 แสดงให้เห็นว่าความบริสุทธิ์ของโปรตีนค่อนข้างสูงและการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกน้อยที่สุด สำหรับโปรตีนที่มีกรดนิวคลีอิกที่ถูกผูกไว้อย่างรุนแรงพวกเขาสามารถถูกทำลายชั่วคราว (เช่นการรักษาด้วยยูเรีย) จากนั้นทำการฟื้นฟู ประเด็นสำคัญ: ใช้รีเอเจนต์คุณภาพสูงบัฟเฟอร์สดและคอลัมน์ที่สะอาด (ทำความสะอาดด้วย 0.5m NaOH ก่อนการใช้งาน)

 

2. เมาส์เฟอร์ริตินโซ่หนัก:

จุดประสงค์ของการผลิตโปรตีนเชนเมาส์บริสุทธิ์ (MFTH1) โปรตีนคือกล้องจุลทรรศน์ Cryo-electron-electron ความละเอียดสูง (Cryo-EM) เวกเตอร์นิพจน์ Escherichia coli ที่เข้ารหัส MFTH1 ที่ไม่มีป้ายกำกับถูกรบกวนทางอัลตร้าซอนโดยไม่ต้องเพิ่มนิวเคลียสใด ๆ หลังจากให้ความร้อนที่ 7 0 องศามันได้รับการตกตะกอนแอมโมเนียมซัลเฟตการล้างไตและขั้นตอนการยกเว้นขนาดโครมาโตกราฟี ตัวอย่างที่เกิดขึ้นแสดงให้เห็นว่ามีสารปนเปื้อนจำนวนมากในภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแช่แข็ง (รูปที่ 2A) ซึ่งไม่เหมาะสมอย่างสมบูรณ์สำหรับการใช้งาน เพิ่มประสิทธิภาพขั้นตอน เพิ่ม SM nuclease ในระหว่างกระบวนการ lysis เซลล์และกระบวนการล้างไตหลังจากการตกตะกอนแอมโมเนียมซัลเฟตจากนั้นเพิ่มขั้นตอนการแลกเปลี่ยนประจุลบโครมาโตกราฟีเพื่อลดอัตราส่วนของ A26 0 nm\/a280nm จาก 1.4 เป็น 0.8 หลังจากการยกเว้นขนาดโครมาโตกราฟีอัตราส่วนของ A260NM\/A280NM ของตัวอย่าง MFTH1 สุดท้ายคือ 0.56 ภาพกล้องจุลทรรศน์ SDS-PAGE และ Cryo-Electron (รูปที่ 2B) แสดงให้เห็นว่าโปรตีนนั้นบริสุทธิ์มากแสดงให้เห็นว่าสารปนเปื้อนได้ถูกกำจัดออกไปอย่างมีประสิทธิภาพ

รูปที่ 2 เมาส์เฟอร์ริตินห่วงโซ่หนัก

 

 

 

3. DSRBEC โปรตีน chimeric (dsrbd-egf- chimera):

DSRBEC เกิดจากการหลอมรวมของโดเมน RNA ที่มีผลผูกพันสองเส้น (DSRBD) ของโปรตีนไคเนส r และปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังมนุษย์ (HEGF) เมื่อ DSRBD แสดงใน Escherichia coli มันจะแสดงความสามารถในการผูกมัด dsRNA ที่สูงมาก หลังจากการสลายของเซลล์ RNA ที่ปนเปื้อนจะขัดขวางการจับตัวของโปรตีน recombinant กับคอลัมน์ chromatography (IMAC) ของโลหะคงที่ วิธีการทั่วไปเช่นการตกตะกอน PEI หรือ streptomycin ซัลเฟตการรักษา RNase หรือสารละลายบัฟเฟอร์เกลือสูงไม่สามารถกำจัด RNA ได้ การสลายเซลล์ดำเนินการโดยใช้บัฟเฟอร์ที่มียูเรีย 4M supernatant ถูกโหลดลงในคอลัมน์ iMac และ 4m ถึง 0 m ยูเรียถูกใช้อย่างช้าๆในชั่วข้ามคืน (การปรับปรุงคอลัมน์) บัฟเฟอร์การบูรณะใหม่ถูกเพิ่มเข้ากับ imidazole และ eluted จากคอลัมน์ iMac การปรับแต่งครั้งสุดท้ายได้ดำเนินการผ่านการกรอง Superdex 75 Gel เพื่อให้ได้ DSRBEC ที่ใช้งานได้

 

4. โปรตีนที่ถูกผูกไว้กับประจุบวกหรือปัจจัยอื่น ๆ :

สำหรับโปรตีนที่โต้ตอบกับประจุบวก divalent เช่น zn 2+, fe 2+, cu 2+ หรือ cofactors อื่น ๆ เป็นสิ่งสำคัญที่จะเพิ่มไอออนบวกเฉพาะ (หรือ cofactors อื่น ๆ ) ในระหว่างการแสดงออก นอกจากนี้ยังจำเป็นต้องมีไอออนบวก divalent จำนวนเล็กน้อย (หรือ cofactors อื่น ๆ ) ในระหว่างกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ อย่างไรก็ตามการใช้สาร chelating ใด ๆ (เช่น EDTA, EGTA) และการลดการคีเลตของตัวแทน (เช่น DTT หรือ DTE) จะต้องหลีกเลี่ยง เมื่อจัดการกับโปรตีนที่ผูกพันกับประจุบวก divalent จะต้องใช้ส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอสโดยไม่ต้องใช้สารคีเลตในการยืนยันการปรากฏตัวที่แท้จริงของประจุบวก (หรือปัจจัยอื่น ๆ ) ในโปรตีนบริสุทธิ์ผ่านวิธีสเปกโทรสโกปี

 

5. recombinant ferridoxin (RFD) ที่มีกลุ่ม [2Fe ± 2S] เดี่ยวจาก thermophilic cyanobacteria mastigocladus laminosus

Ferridoxin เป็นโปรตีนเหล็กซัลเฟอร์ที่ละลายน้ำได้ซึ่งมีส่วนร่วมในปฏิกิริยาการถ่ายโอนอิเล็กตรอน ferroredoxin ชนิดพืชมีกลุ่ม [2Fe ± 2S] เดียวในฐานะตัวรับอิเล็กตรอนของระบบถ่ายภาพ I. Escherichia coli BL21 (DE3) สายพันธุ์แสดงโปรตีน RFD recombinant ในสื่อ TB ที่มี 10 มม. fecl3 และยาปฏิชีวนะ การชะล้างคอลัมน์ Imac Capture ดำเนินการโดยใช้บัฟเฟอร์ที่มีฮิสทิดีน 10 มม. เพื่อหลีกเลี่ยง imidazole และป้องกันการทำลายของคลัสเตอร์ [2FE ± 2S] การแลกเปลี่ยนประจุลบและการยกเว้นขนาดโครมาโตกราฟีถูกนำมาใช้เพื่อการทำให้บริสุทธิ์และความเข้มข้นต่อไปถึง 12 มก.\/มล. สำหรับการตรวจคัดกรองการตกผลึก เมื่อเทียบกับการผลิต recombinant ของ ferroredoxin, ferroredoxin ธรรมชาติบริสุทธิ์จากสาหร่ายสีน้ำเงิน-กรีน mastigocladus laminosus ได้รับความละเอียดสูงขึ้นในระหว่างการตกผลึก

 

6. โปรตีนที่ใช้เป็นแอนติเจน

โปรตีนมักใช้เป็นแอนติเจนในการกู้คืนแกนด์เฉพาะเป้าหมาย สิ่งแรกที่ต้องพิจารณาคือว่าโปรตีนถูกใช้ในการสร้างภูมิคุ้มกันในร่างกายเพื่อให้ได้ monoclonal แบบดั้งเดิมหรือ polyclonal IgG หรือสำหรับโปรแกรมที่เกี่ยวข้องกับอูฐ IgG หรือกระบวนการเลือกในหลอดทดลอง

 

6.1 แอนติเจนที่ใช้สำหรับการผลิตแอนติบอดีประจำ

เมื่อแอนติเจนถูกนำมาใช้ในการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี IgG การพับแอนติเจนที่ถูกต้องมักจะไม่จำเป็นเพราะแอนติบอดี้โมโนโคลนอลส่วนใหญ่จะรับรู้ epitopes เชิงเส้นที่ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมากจากโครงสร้างของแอนติเจนและแม้แต่แอนติเจนที่ถูกทำลาย อย่างไรก็ตามความบริสุทธิ์จะต้องถูกควบคุมอย่างเคร่งครัดเพื่อหลีกเลี่ยงสารปนเปื้อนที่มีภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งซึ่งรบกวนการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันและทำให้เกิดการครอบงำของแอนติบอดีที่ไม่ใช่เป้าหมาย

 

6.2 การคัดกรองห้องสมุดคอนจูเกต

ควรให้ความสนใจเป็นพิเศษเพื่อรักษาโครงสร้างตามธรรมชาติของแอนติเจนในระหว่างการประมวลผลของห้องสมุดนาโนบอดี้ที่ได้รับจากการฉีดวัคซีนอูฐ ซึ่งแตกต่างจากแอนติบอดีทั่วไปแอนติบอดีอูฐ (โดยเฉพาะ nanobodies) มีแนวโน้มที่จะรับรู้ epitopes โครงสร้างซึ่งเกี่ยวข้องกับโครงสร้างไซต์เสริมที่เป็นเอกลักษณ์ของพวกเขา ในทำนองเดียวกันเมื่อคัดกรองห้องสมุดแอนติบอดีสังเคราะห์หรือธรรมชาติขนาดใหญ่ในหลอดทดลองแอนติเจนจะต้องรักษาโครงสร้างที่สอดคล้องกับแอปพลิเคชันเป้าหมายอย่างสมบูรณ์ เนื่องจากกระบวนการตรวจคัดกรองนั้นไม่ได้มีอคติหากแอนติเจนมีความผิดพลาดการรวมหรือความหลากหลายของโครงสร้างจำนวนของคอนจูเกตจำนวนมากที่กำหนดเป้าหมาย epitopes ที่ไม่ใช่ธรรมชาติอาจถูกคัดกรอง

 

 

 

7. โปรตีนที่มีพันธบัตรระหว่างโมเลกุลหรืออินเทอร์โมเลกุลหรือซีสเตอีนอิสระ

พันธะซัลไฟด์มีความสำคัญต่อการทำให้โครงสร้างตามธรรมชาติของโปรตีนคงที่ ในระหว่างกระบวนการทำให้บริสุทธิ์เมื่อบริสุทธิ์โปรตีนที่มีพันธะระหว่างโมเลกุลหรือโมเลกุลไดซัลไฟด์นั้นจำเป็นต้องหลีกเลี่ยงการเพิ่มสารลดลงเพื่อป้องกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของโปรตีนซึ่งจะเปลี่ยนการทำงานของพวกเขา สำหรับโปรตีนที่มีซีสเตอีนอิสระการลดสารเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้ในทุกขั้นตอนของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในระหว่างการจัดเก็บเพื่อป้องกันการก่อตัวของพันธะซัลไฟด์เทียม สารลดที่ใช้กันมากที่สุดคือ dithiothreitol (dtt), -mercaptoethanol (-me) และ tris (2- carboxyethyl) ฟอสฟีนไฮโดรคลอไรด์ (TCEP) สำหรับเรซิน IMAC ที่เข้ากันไม่ได้กับ DTT หรือ TCEP ขอแนะนำให้ใช้ -ME และแทนที่ด้วยสารลดอื่น ๆ ในขั้นตอนต่อไป

 

8. ชิ้นส่วนแอนติบอดี recombinant

แม้ว่าโครงสร้างของชิ้นส่วนแอนติบอดี recombinant (เช่น nanobodies) นั้นง่ายกว่าของ IgG แต่ฟังก์ชั่นของพวกเขาขึ้นอยู่กับการก่อตัวของพันธะซัลไฟด์ที่ถูกต้อง ในระบบการแสดงออกของแบคทีเรียแม้จะมีการใช้กลยุทธ์การเพิ่มประสิทธิภาพผลิตภัณฑ์ที่ถูกพับไม่ได้หรือบางส่วนอาจยังคงเกิดขึ้นซึ่งมีอยู่ทั้งในส่วนที่ละลายน้ำได้และในร่างกายรวม ปกปิดมากขึ้นคือชิ้นส่วนแอนติบอดีที่พับได้อย่างถูกต้องอาจก่อให้เกิดมวลรวมที่ละลายน้ำได้ (การรวมคอลลอยด์) ผ่านโล่ที่ไม่ชอบน้ำบนพื้นผิว มวลรวมดังกล่าวเป็นเรื่องยากที่จะระบุในการทดสอบการทำงานตามปกติ (เช่น ELISA) เนื่องจากการผูกมัดหลายครั้งอาจปกปิดการลดลงของความสัมพันธ์แบบโมโนเมอร์ แต่การปรากฏตัวของพวกเขาอาจส่งผลกระทบอย่างรุนแรงต่อการใช้งานที่ต้องพึ่งพาขนาดโมเลกุลขนาดเล็ก (เช่นกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูง) ดังนั้นการพึ่งพา SDS-PAGE เพียงอย่างเดียวจึงไม่เพียงพอที่จะประเมินคุณภาพตัวอย่าง วิธีการทางชีวฟิสิกส์เช่นการกรองเจล (รูปที่ 3) จะต้องนำมาใช้เพื่อแยกความแตกต่างของโมโนเมอร์ (ยอดเขาหลัก) จากมวลรวม (ยอดรวมระดับสูงสุด) จุดควบคุมที่สำคัญรวมถึง: การเพิ่มประสิทธิภาพสภาพแวดล้อมรีดอกซ์ในระหว่างการแสดงออกเพื่อส่งเสริมการสร้างพันธะซัลไฟด์และการเพิ่มประสิทธิภาพเงื่อนไขการจัดเก็บหลังจากการทำให้บริสุทธิ์เพื่อป้องกันการรวมตัว มาตรการเหล่านี้มีความสำคัญต่อการสร้างความมั่นใจว่า monodispersity และการทำงานของชิ้นส่วนแอนติบอดี

รูปที่ 3. การแยกการกรองเจลของมวลรวมที่ละลายน้ำได้ของ nanobodies

 

9. ชิ้นส่วนที่ละลายน้ำได้ของ Lymphocyte receptor LLT1

การแสดงออกของ Recombinant ของโปรตีนที่ขึ้นกับพันธะไดซัลไฟด์ (เช่น Lymphocyte receptor LLT1) มักจะเผชิญกับความยากลำบากในการพับ การกรองเจลของ Wild-type LLT1 แสดงให้เห็นถึงจุดสูงสุดของการรวมตัวและยอดเขาหรี่แสง (รูปที่ 4A) แต่มวลสารสเปคโตรมิเตอร์เผยให้เห็นการผิดพลาดที่เกิดจากซีสเตอีนที่ไม่มีคู่ใน dimer (รูปที่ 4B) เพื่อจุดประสงค์นี้มีการออกแบบสองสายพันธุ์: หนึ่งลบปัญหา cysteine ​​ทำให้ผลผลิตลดลงอย่างฉับพลัน (รูปที่ 4a); หลังจากการแนะนำของ neocysteine ​​เพื่อสร้างพันธะไดซัลไฟด์ที่สอดคล้องกันการกลายพันธุ์ไม่เพียง แต่ให้ผลผลิตสูงและเสถียรภาพที่ดี แต่ยังสามารถตกผลึก (รูปที่ 4C) และโครงสร้าง 3 มิติยืนยันว่าการกลายพันธุ์ก่อให้เกิดพันธะซัลไฟด์ที่ถูกต้อง กรณีนี้แสดงให้เห็นว่าโดยการออกแบบพันธะซัลไฟด์ที่สอดคล้องกันอย่างมีเหตุผลรวมกับการกรองเจลและการวิเคราะห์มวลสารสเปคโตรเมตรีปัญหาการพับของโปรตีน recombinant สามารถแก้ไขได้อย่างมีประสิทธิภาพและโปรตีนที่ใช้งานได้ที่มีโครงสร้างที่เสถียรและผลผลิตสูง

รูปที่ 4. การสร้างพันธบัตรไดซัลไฟด์ช่วยเพิ่มการพับและผลผลิตของ LLT1 ที่ละลายน้ำได้

 

 

 

10. โปรตีนที่รวมได้ง่าย

การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน recombinant มักจะเผชิญกับปัญหาของการรวมตัวและการก่อตัวของมันเป็นไปตามกลไก "การเติบโตของนิวเคลียส"-การรวมตัวที่ละลายน้ำได้จำนวนเล็กน้อยก่อตัวเป็นครั้งแรกและทำให้เกิดการรวมตัวกันที่ไม่ละลายน้ำขนาดใหญ่ เพื่อจัดการกับความท้าทายนี้ต้องนำกลยุทธ์หลายระดับมาใช้: ในขั้นตอนการแสดงออกสิ่งนี้สามารถทำได้โดยการเพิ่มประสิทธิภาพความเครียดลดอุณหภูมิวัฒนธรรมโดยใช้สื่อวัฒนธรรมดัดแปลงหรือการละลายโปรตีนฟิวชั่นที่แตกต่างกัน IMAC ถึง Sec) ควรนำมาใช้เพื่อกำจัดนิวเคลียสรวมทันที โดยทั่วไปเมื่อการคัดกรองสารละลายบัฟเฟอร์ปัจจัยต่าง ๆ เช่นองค์ประกอบขององค์ประกอบค่า pH, ตัวแทนแยกส่วนหรือตัวทำละลายควรนำมาพิจารณา (รูปที่ 5) ผ่านการเพิ่มประสิทธิภาพที่ดีของการตรวจจับแบบมุมฉาก (เช่น SEC, CD, LS, DSF และการเปลี่ยนอุณหภูมิตามความร้อนของฟลูออเรสเซนต์ ฯลฯ ) คุณภาพโปรตีนและสารละลายบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมที่สุด

รูปที่ 5. กลยุทธ์ในการบรรเทาการรวมโปรตีน

 

11. การตกผลึกของมนุษย์ clk1 kinase (วิธีการรับแบทช์ที่ทำซ้ำได้)

เพื่อให้ได้ Kinase Clk1 kinase ที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกันสำหรับการศึกษาการตกผลึกได้นำรูปแบบการทำงานร่วมกันแบบหลายกลยุทธ์มาใช้ ประการแรกมันถูกแสดงออกร่วมกับλ -phosphatase ใน Escherichia coli เพื่อกำจัดความหลากหลายของ autophosphorylation แม้ว่าผลผลิตจะลดลง หลังจากถูกจับโดย iMac, eluent ได้รับการเสริมด้วยความคงตัว (อาร์จินีน 50 มม., กรดกลูตามิก 50 มม. และ 10 มม. DTT) เพื่อป้องกันการรวมตัว, เข้มข้น, และแท็กของเขาถูกลบออกโดยการย่อย TEV จากนั้น oligomer ที่ถูกต้องจะถูกคั่นด้วย SEC (มีกลีเซอรอล 5% และ -ME) ขั้นตอนการแลกเปลี่ยนประจุลบที่สำคัญที่สุดจะแยกความแตกต่างระหว่างผลึก (ไม่ใช่ฟอสฟอรัส) และกลุ่มที่ไม่ใช่ผลึก (บางส่วน phosphorylated) กลุ่ม CLK1 เป็นที่น่าสังเกตว่าโหมดการสลายของเซลล์มีผลต่อความเสถียรของโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญ-วิธีการแรงดันสูงและอุณหภูมิสูงนำไปสู่การรวมตัวของ CLK1 ที่ไม่สามารถย้อนกลับได้โดยเน้นถึงความสำคัญของการรักษาไคเนส

 

 

 

12. ผลิต galectin -1 ด้วยความสามารถในการผูกมัดแกนด์ที่เสถียร

ในการเตรียม galectin ที่ใช้งานได้ -1 สำหรับการศึกษาที่มีผลผูกพันแกนด์, การแสดงออกและกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์ของสี่โครงสร้าง (ไม่มีป้ายกำกับและ galectin ชนิดป่าที่ติดฉลากของเขา -1, ไม่มีป้ายกำกับ การค้นพบที่สำคัญบ่งชี้ว่าการทำให้บริสุทธิ์โครมาโตกราฟี Lactose Cromatography สามารถคัดกรองโปรตีนที่พับได้อย่างถูกต้อง แต่จำเป็นต้องรวมกับการล้างไตอย่างละเอียด (บัฟเฟอร์ HEPES) เพื่อกำจัดแลคโตสออกจากไซต์ที่มีผลผูกพันและคืนกิจกรรม CRD galectin ประเภทป่า -1 มีแนวโน้มที่จะเกิดออกซิเดชันและการหยุดทำงานและความมั่นคงของมันยังคงมี จำกัด แม้ในที่ที่มีสารลดลง (รูปที่ 6) อย่างไรก็ตามการกลายพันธุ์ที่ปราศจาก cysteine ​​ช่วยเพิ่มเสถียรภาพในระยะยาวอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่ยังคงรักษากิจกรรมการเกาะติดกันที่เปรียบเทียบได้และความเสถียรทางความร้อน (ตรวจสอบโดย nanodsf, ITC ฯลฯ ) โดยการกำจัดการพึ่งพาพันธะไดซัลไฟด์

รูปที่ 6. การจำแนกลักษณะอุทกพลศาสตร์ของ recombinant galectin -1 เผยให้เห็นความไม่แน่นอนของมัน

 

13. การกำจัด endotoxin

วิธีการกำจัดเอนโดท็อกซินขึ้นอยู่กับโครมาโตกราฟี Affinity รวมถึงโครมาโตกราฟีที่มีประจุบวก (การแลกเปลี่ยนประจุลบ) การใช้ลิแกนด์ polycationic (เช่นโพลี-L-lysine (PLL), โพลีอะมีนที่ถูกตรึง ในระหว่างกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ให้ความสนใจกับการเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์ด้วยน้ำที่ปราศจาก LPS และใช้คอลัมน์หรือคอลัมน์ใหม่ที่ใช้ในการทำให้บริสุทธิ์แบบปราศจาก LPS อื่น ๆ เท่านั้น สำหรับการปนเปื้อนของ endotoxin ระบบปั๊ม\/ของเหลว chromatographic สามารถบ่มในชั่วข้ามคืนใน 0. 5m NaOH หรือ 4 ชั่วโมงใน 1 0 M NaOH จำนวน LPS สุดท้ายในตัวอย่างได้รับการประเมินโดยใช้ Limulus amebocyte lysate reagent (LAL) และได้รับการตรวจสอบว่าต่ำกว่าขีด จำกัด ที่จำเป็นสำหรับการใช้งานเฉพาะหรือไม่

 

14. โปรตีนคอมเพล็กซ์

การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของคอมเพล็กซ์โปรตีนจำเป็นต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมตามเงื่อนไขเฉพาะ ความท้าทายรวมถึงความไม่แน่นอนหรือการกำหนดความผิดพลาดของหน่วยย่อย แต่ละหน่วยย่อยสามารถแสดงได้อย่างอิสระและประกอบในหลอดทดลองหรือร่วมกันเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์โปรตีนที่ใช้งานได้ การออกแบบการก่อสร้างควรได้รับการแนะนำอย่างรอบคอบด้วยการทำให้บริสุทธิ์หรือฉลากตรวจจับเพื่อหลีกเลี่ยงการแทรกแซงการประกอบโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อข้อมูลที่ซับซ้อนมี จำกัด และจำเป็นต้องมีการปรับให้เหมาะสมหลายครั้ง ในระหว่างกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ความสมบูรณ์และความเสถียรของความซับซ้อนจำเป็นต้องได้รับการประเมิน วิธีการรวมถึง SDS-PAGE (การตรวจจับ subunit), SEC (ความเป็นเนื้อเดียวกัน), SEC-mals (การวิเคราะห์มวลโมลาร์), photometry มวลหรือสเปกโตรเมตรีมวลธรรมชาติ (การตรวจสอบมวล) ควรสังเกตว่าคอมเพล็กซ์อาจแยกตัวออกจากความเข้มข้นต่ำ ในเวลานี้วิธีการโครมาโตกราฟีหรือบัฟเฟอร์ (เช่นผ่านผ่านความร้อนดริฟท์หรือเงื่อนไขการคัดกรอง DSF) จะต้องได้รับการปรับให้เหมาะสม นอกจากนี้การลดขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สามารถป้องกันการสูญเสียหน่วยย่อยการโต้ตอบที่อ่อนแอและปรับสมดุลประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์และความสมบูรณ์ของคอมเพล็กซ์

 

 

 

15. การทำให้บริสุทธิ์ของคอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดี

คอมเพล็กซ์แอนติบอดี-แอนติเจนเป็นตัวอย่างทั่วไปของคอมเพล็กซ์โปรตีน การตกผลึกร่วมของพวกเขาสามารถเปิดเผยรูปแบบที่มีผลผูกพันและเป็นแนวทางในการเพิ่มประสิทธิภาพของวิศวกรรมแอนติบอดี วิธีการดั้งเดิมต้องการการทำให้บริสุทธิ์ของแอนติเจนและแอนติบอดีแยกต่างหากจากนั้นผสม อย่างไรก็ตามการศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกร่วมกันและกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์มีประสิทธิภาพมากขึ้น จำเป็นต้องมีการทำให้บริสุทธิ์เพียงครั้งเดียวเพื่อให้ได้ความซับซ้อนและในเวลาเดียวกันแอนติเจนที่ไม่เสถียรสามารถทำให้เสถียรผ่านแอนติบอดีและแม้แต่การแสดงออกที่ปราศจากฉลากก็สามารถทำได้ ในสถานการณ์เฉพาะนี้การกรอง SDS-PAGE และ GEL (SEC) มักจะเพียงพอที่จะประเมินความบริสุทธิ์และคุณภาพของคอมเพล็กซ์

 

สรุป

การทำให้บริสุทธิ์โปรตีนเป็นเทคโนโลยีพื้นฐานในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ การผลิตโปรตีนในระดับวิชาการมักจะเป็นไปตามกลยุทธ์มาตรฐานและสามารถผลิตโปรตีนที่มีความบริสุทธิ์สูงในระดับมิลลิกรัมโปรตีนที่ละลายน้ำได้ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาโครงสร้างชีวเคมีและการวิจัยการทำงาน อย่างไรก็ตามข้อกำหนดพิเศษของการใช้งานดาวน์สตรีม (เช่นความต้องการเอนโดท็อกซินในการทดลองสัตว์และไม่มีการปนเปื้อนของนิวเคลียสในการวิจัยกรดนิวคลีอิก) หรือลักษณะโดยธรรมชาติของโปรตีน (เช่นการรวมตัวง่ายที่มีพันธะซัลไฟด์ การทบทวนนี้ในการตอบสนองต่อสถานการณ์พิเศษเหล่านี้เสนอกลยุทธ์การกลั่นตั้งแต่การเลือกระบบการแสดงออกการออกแบบโครงสร้าง (การเพิ่มประสิทธิภาพฉลากและขอบเขตโดเมน) ไปจนถึงกระบวนการทำให้บริสุทธิ์และแนะนำการควบคุมคุณภาพ (เช่น SEC, SDS-PAGE, การตรวจจับกิจกรรม ฯลฯ ) ที่ขั้นตอนสำคัญ แอพพลิเคชั่นบางตัวยังต้องการการวิเคราะห์เพิ่มเติม (เช่นการตรวจจับเอนโดท็อกซินและการกำหนดสารตกค้างของกรดนิวคลีอิก) คล้ายกับแนวคิด "การประกันคุณภาพ" (QA) ในอุตสาหกรรมยาชีวภาพนั่นคือเพื่อป้องกันข้อบกพร่องผ่านกระบวนการที่เป็นระบบ โดยการกำหนดแนวทางการควบคุมคุณภาพและการชี้แจงมาตรฐานเฉพาะสำหรับรีเอเจนต์โปรตีนที่ใช้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์จุดมุ่งหมายคือการสร้างบรรทัดฐานการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่เข้มงวดยิ่งขึ้นสำหรับห้องปฏิบัติการวิชาการเพิ่มความน่าเชื่อถือและความสามารถในการทำซ้ำของข้อมูลการทดลองและเชื่อมช่องว่างระหว่างการวิจัยขั้นพื้นฐานและมาตรฐานอุตสาหกรรม

 

doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5