หลักการพื้นฐานและขั้นตอนการทำงานของการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็ง (SPPS)

การสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง (SPPS)เป็นวิธีสังเคราะห์เปปไทด์บนตัวรองรับที่เป็นของแข็ง กลยุทธ์หลักของ SPPS ได้แก่วิธีการบอคและวิธีเอฟเอ็มโอค. การสังเคราะห์เปปไทด์เป็นกระบวนการซ้ำๆ ของการเติมกรดอะมิโนตามลำดับ และโดยทั่วไปจะดำเนินการจากปลายทาง C- (ปลายคาร์บอกซิล)ไปที่ปลายทาง N- (ปลายอะมิโน). ขั้นแรก กลุ่มคาร์บอกซิลของกรดอะมิโนตัวแรกของเปปไทด์เป้าหมายจะถูกยึดติดด้วยโควาเลนต์กับส่วนรองรับที่เป็นของแข็ง (เรซิน) การใช้หมู่อะมิโนของกรดอะมิโนนี้เป็นจุดเริ่มต้น หมู่ป้องกันที่ปลาย N- จะถูกเอาออก และสายเพปไทด์ที่กำลังเติบโตจะถูกยืดออกโดยการทำปฏิกิริยากับกรดอะมิโนตัวที่สองที่ถูกกระตุ้นที่มากเกินไป รอบนี้-การมีเพศสัมพันธ์ → การซัก → การปลดการป้องกัน → การทำให้เป็นกลางและการซัก → การมีเพศสัมพันธ์ครั้งต่อไป-ถูกทำซ้ำจนกระทั่งได้ความยาวเพปไทด์ที่ต้องการ ในที่สุด สายโซ่เปปไทด์จะถูกแยกออกจากเรซินและทำให้บริสุทธิ์เพื่อให้ได้เปปไทด์เป้าหมาย เมื่อ -หมู่อะมิโนได้รับการคุ้มครองด้วยบอค (เติร์ต-บิวทิลออกซีคาร์บอนิล)วิธีการนี้เรียกว่าการสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง-แบบ Boc. เมื่อ -หมู่อะมิโนได้รับการปกป้องด้วยFmoc (9-ฟลูออเรนิลเมทิลออกซีคาร์บอนิล)เป็นที่รู้จักกันในนามการสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง-โดย Fmoc.

 

การสังเคราะห์เปปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง-แบบอิง Boc (วิธี Boc)

ในวิธีการบอค, หมู่ Boc ที่ถอดออกได้โดยกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA)ถูกใช้เพื่อปกป้อง-หมู่อะมิโนในขณะที่กลุ่มป้องกันประเภทเบนซิล-ใช้สำหรับโซ่ด้านข้าง ในระหว่างการสังเคราะห์ กรดอะมิโน-ที่ได้รับการป้องกัน -ของ Boc จะถูกเชื่อมโยงโควาเลนต์กับเรซินในขั้นแรก จากนั้นหมู่ Boc จะถูกกำจัดออกด้วย TFA และปลายทางอะมิโนอิสระที่เป็นผลลัพธ์จะถูกทำให้เป็นกลางด้วยไตรเอทิลเอมีน กรดอะมิโนถัดไปถูกกระตุ้นโดยใช้DCC (ไดไซโคลเฮกซิลคาร์โบไดอิไมด์)และควบคู่กับการยืดสายโซ่เปปไทด์ หลังจากเสร็จสิ้นการประกอบ เปปไทด์เป้าหมายจะถูกแยกออกจากเรซินโดยใช้กรดแก่ โดยทั่วไปแอนไฮดรัสไฮโดรเจนฟลูออไรด์ (HF)หรือกรดไตรฟลูออโรมีเทนซัลโฟนิก (TFMSA)ในวิธีการสังเคราะห์ Boc จำเป็นต้องมีการบำบัดด้วยกรดซ้ำๆ เพื่อกำจัดกลุ่มปกป้องออกก่อนขั้นตอนการควบคู่แต่ละขั้น สิ่งนี้สามารถนำไปสู่ปฏิกิริยาข้างเคียงหลายประการ เช่น การแตกแยกของเปปไทด์จากเรซินก่อนวัยอันควร และความไม่เสถียรของสายข้างกรดอะมิโนภายใต้สภาวะที่เป็นกรด ส่งผลให้เกิดปฏิกิริยาข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์

 

การสังเคราะห์เฟสเปปไทด์แบบเฟส-ที่เป็นของแข็ง-แบบ Fmoc (วิธี Fmoc)

ใน1978, ไมเอนโฮเฟอร์ และเอเธอร์ตันพัฒนากลยุทธ์การสังเคราะห์เปปไทด์โดยใช้Fmoc (9-ฟลูออเรนิลเมทิลออกซีคาร์บอนิล)ในฐานะ -กลุ่มปกป้องอะมิโน หรือที่รู้จักในชื่อวิธีเอฟเอ็มโอค. ในแนวทางนี้ -หมู่อะมิโนได้รับการปกป้องด้วยฐาน-Fmoc ที่มีห้องปฏิบัติการในขณะที่โซ่ด้านข้างได้รับการปกป้องด้วยกลุ่มป้องกันประเภทกรด-labile Boc-.ข้อได้เปรียบที่สำคัญของ Fmoc ในฐานะกลุ่มปกป้องอะมิโน-ก็คือความเสถียรภายใต้สภาวะที่เป็นกรด; มันไม่ได้รับผลกระทบจากการบำบัดด้วยรีเอเจนต์เช่นกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA)และสามารถเลือกเอาออกได้โดยใช้ฐานอ่อน. ในเวลาเดียวกัน กลุ่มป้องกันสายโซ่ด้านข้าง- เช่น Boc มีความเสถียรภายใต้สภาวะพื้นฐานและถูกกำจัดออกภายใต้การบำบัดที่เป็นกรด สุดท้าย เปปไทด์จะถูกแยกออกจากเรซินในเชิงปริมาณโดยใช้TFA/ไดคลอโรมีเทน (DCM)หลีกเลี่ยงการใช้กรดแก่ จึงช่วยเพิ่มความปลอดภัยและความเข้ากันได้กับการสังเคราะห์เปปไทด์เป็นประจำ

 

ประวัติความเป็นมาของการสังเคราะห์-เฟสเปปไทด์ที่เป็นของแข็ง (SPPS)

1.ขั้นพื้นฐาน (ต้นศตวรรษที่ 20 ถึง พ.ศ. 2506)

ใน1902, เอมิล ฟิชเชอร์เป็นคนแรกที่สำรวจการสังเคราะห์เปปไทด์ แต่ความคืบหน้าช้าเนื่องจากข้อจำกัดทางเทคนิค ใช้การสังเคราะห์ในช่วงแรกกลุ่มปกป้องเบนโซอิลและอะเซทิลซึ่งยากจะกำจัดและมักนำไปสู่ความแตกแยกของโซ่เปปไทด์.

ใน1932, แม็กซ์ เบิร์กแมนน์และเพื่อนร่วมงาน-ได้แนะนำหมู่เบนซิลออกซีคาร์บอนิล (Z)ในฐานะ -กลุ่มปกป้องอะมิโน กลุ่มนี้สามารถลบออกภายใต้ตัวเร่งปฏิกิริยาไฮโดรจิเนชันหรือสภาวะที่เป็นกรดซึ่งเป็นเครื่องมือที่เชื่อถือได้มากขึ้นสำหรับการสังเคราะห์เปปไทด์ และวางรากฐานสำหรับการพัฒนาการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง-ในทศวรรษ 1960

ในระหว่าง1950sนักวิทยาศาสตร์สามารถสังเคราะห์ได้สำเร็จหลายชนิดเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ, เช่นออกซิโตซินและอินซูลิน. ความสำเร็จเหล่านี้ช่วยต่อยอดเคมีเปปไทด์ขั้นสูง และสร้างรากฐานสำหรับการเกิดขึ้นของการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็ง

 

2.เวทีบุกเบิก (1963)

ใน1963, โรเบิร์ต บี. เมอร์ริฟิลด์เสนอวิธีการสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง (SPPS)ซึ่งในกรดอะมิโนที่ปลาย C-ถูกยึดไว้กับส่วนรองรับเรซิน และสายโซ่เปปไทด์ถูกยืดออกผ่านวงจรซ้ำๆ ของการปลดการป้องกันและการมีเพศสัมพันธ์. แนวทางนี้ทำให้กระบวนการสังเคราะห์เปปไทด์ง่ายขึ้นอย่างมากและกลายเป็นวิธีที่ต้องการสำหรับการประกอบเปปไทด์

เมอร์ริฟิลด์ใช้แล้วบอค (เติร์ต-บิวทิลออกซีคาร์บอนิล)เพื่อปกป้อง -หมู่อะมิโน ในช่วงปลายทศวรรษ 1960 เขายังพัฒนาเครื่องสังเคราะห์เปปไทด์อัตโนมัติเต็มรูปแบบเครื่องแรกและสังเคราะห์ได้สำเร็จโปรตีนทางชีวภาพเช่นไรโบนิวคลีเอส (กรดอะมิโน 124 ตัว). สำหรับความสำเร็จอันก้าวล้ำเหล่านี้ Merrifield ได้รับรางวัลรางวัลโนเบลสาขาเคมีในปี 1984.

 

3.เวทีนวัตกรรมเทคโนโลยี (2515)

ใน1972, ลู คาร์ปิโนพัฒนากลุ่มปกป้อง 9-ฟลูออเรนิลเมทิลออกซีคาร์บอนิล (Fmoc)ซึ่งสามารถเป็นได้ค่อย ๆ ลบออกภายใต้สภาวะพื้นฐาน,ลดปฏิกิริยาข้างเคียง ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับเปปไทด์ที่ซับซ้อนและการสังเคราะห์อัตโนมัติ.

ที่วิธีเอฟเอ็มโอคค่อยๆ แทนที่วิธี Boc มาเป็นกลยุทธ์กระแสหลัก เครื่องสังเคราะห์เปปไทด์อัตโนมัติที่ใช้ทั้งสองอย่างเคมีของ Fmoc และ Bocต่อมาได้พัฒนาขับเคลื่อนการระบบอัตโนมัติของการสังเคราะห์เปปไทด์และปรับปรุงประสิทธิภาพและความสามารถในการทำซ้ำอย่างมาก

 

4.ระยะการเจริญเติบโตและการขยายตัว (พ.ศ. 2533 ถึงปัจจุบัน)

การเพิ่มประสิทธิภาพเรซินและรีเอเจนต์:การพัฒนาของเรซินดัดแปร PEG ที่ชอบน้ำ-สูง-และรีเอเจนต์คัปปลิ้งที่มีประสิทธิภาพ เช่นเอชบีทียูและฮาตูได้ปรับปรุงประสิทธิภาพและผลผลิตของการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็ง (SPPS) อย่างมีนัยสำคัญ

การบูรณาการทางเทคโนโลยี:แนวทางใหม่เช่นการสังเคราะห์ด้วยไมโครเวฟ-และเคมีการไหลทำให้เวลาปฏิกิริยาสั้นลงและเพิ่มผลผลิตมากขึ้น

 

หลักการพื้นฐานและขั้นตอนการทำงานของ SPPS:
หลักการสำคัญของการสังเคราะห์เพปไทด์เฟสของแข็ง-คือการสร้างโซ่เปปไทด์แบบเป็นขั้นตอนบนส่วนรองรับที่มั่นคง, โดยใช้การปกป้องกลยุทธ์ของกลุ่มและปฏิกิริยาการควบแน่น (ข้อต่อ)เพื่อให้บรรลุการประกอบเปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพและควบคุมได้.

1.บทบาทของส่วนรองรับที่เป็นของแข็ง (เรซิน) ในการสังเคราะห์-เฟสเปปไทด์ที่เป็นของแข็ง (SPPS)

A เรซินโพลีเมอร์ที่ไม่ละลายน้ำ-เช่นโพลีสไตรีน-divinylbenzene cross-เรซินเชื่อมโยง เรซิน Wang หรือเรซิน Rink amide-ได้รับเลือกให้เป็นการสนับสนุนที่มั่นคงใน SPPS พื้นผิวเรซินประกอบด้วยกลุ่มการทำงาน(เช่น หมู่ไฮดรอกซิลหรือหมู่อะมิโน) ที่สามารถก่อตัวได้พันธะโควาเลนต์กับปลายด้านหนึ่งของสายเปปไทด์โดยปกติแล้วปลายทางค-โดยยึดเปปไทด์ไว้กับส่วนรองรับที่มั่นคง การยึดติดโควาเลนต์นี้ทำให้มั่นใจได้ว่าเปปไทด์ที่กำลังเติบโตยังคงเกาะติดกับเรซินตลอดการสังเคราะห์ซึ่งอย่างมากช่วยให้เกิดขั้นตอนปฏิกิริยา การล้าง และการทำให้บริสุทธิ์ในภายหลัง

 

2.การปกป้องกลยุทธ์กลุ่มในการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสแข็ง- (SPPS)

ในระหว่างการสังเคราะห์เปปไทด์-หมู่อะมิโน หมู่คาร์บอกซิล และหมู่ฟังก์ชันสายโซ่ด้านปฏิกิริยา-ของกรดอะมิโน (เช่น ไทออล คาร์บอกซิล และหมู่อะมิโน) มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นปฏิกิริยาข้างเคียง. เพื่อป้องกันปฏิกิริยาที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้การปกป้องกลุ่มถูกนำมาใช้ กลุ่มคุ้มครองทั่วไป ได้แก่ :-กลุ่มปกป้องอะมิโน:

บอค (เติร์ต-บิวทิลออกซีคาร์บอนิล):กรด-สามารถลอกออกได้ง่ายข้างใต้สภาวะที่เป็นกรด.

Fmoc (9-ฟลูออเรนิลเมทิลออกซีคาร์บอนิล):มีความคงตัวภายใต้สภาวะที่เป็นกรด สามารถถอดออกภายใต้เงื่อนไขพื้นฐาน(เช่น สารละลายพิเพอริดีน/DMF)ด้านข้าง-กลุ่มป้องกันโซ่:คัดเลือกตามคุณสมบัติทางเคมีของกลุ่มกรดอะมิโนข้างโซ่ออมมอนได้แก่เบนซิล (Bn), เติร์ต-บิวทิล (tBu), ไตรทิล (Trt)ฯลฯ กลุ่มเหล่านี้ได้แก่ลบออกเมื่อสิ้นสุดการสังเคราะห์โดยปกติระหว่างการแตกตัวของเปปไทด์จากเรซินโดยใช้กรดหรือสภาวะเฉพาะอื่น ๆ.

 

3.C-ปลายทางถึง N-การสังเคราะห์ปลายทางใน SPPS

ในการสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง (SPPS)การประกอบเปปไทด์มักจะเริ่มต้นที่ปลายทาง C- (ปลายคาร์บอกซิล)และดำเนินไปเป็นขั้นๆ ไปสู่ปลายทาง N- (ปลายอะมิโน). ทั้งนี้ก็เพราะว่ากรดอะมิโนที่ปลาย C- ถูกติดเข้ากับส่วนรองรับที่เป็นของแข็งก่อนและกรดอะมิโนต่อมาก็มาควบคู่กับกลุ่มอะมิโนอิสระของสายเปปไทด์ที่จับกับเรซินอยู่แล้วค่อยๆยืดสายโซ่เปปไทด์ออก

 

4.ปฏิกิริยาการควบคู่ในการสังเคราะห์-เฟสเปปไทด์ที่เป็นของแข็ง (SPPS)

จำเป็นต้องมีกรดอะมิโนที่ได้รับการป้องกันเปิดใช้งานแล้วเพื่อที่พวกเขาหมู่คาร์บอกซิลจะมีปฏิกิริยาทำให้พวกเขาสามารถสร้างรูปแบบกพันธะเปปไทด์กับกลุ่มอะมิโนของเพปไทด์ที่จับกับเรซิน- ทั่วไปเปิดใช้งานรีเอเจนต์รวมคาร์โบไดอิไมด์(เช่น DCC, DIC)ฮอบ, ฮาตู, และพีบีโอพี. เมื่อเปิดใช้งานแล้ว หมู่คาร์บอกซิลจะทำปฏิกิริยากับหมู่อะมิโนอิสระในปฏิกิริยาการควบแน่น, ขึ้นรูปพันธะเอไมด์และด้วยเหตุนี้จึงจับกรดอะมิโนใหม่เข้ากับสายโซ่เปปไทด์ที่กำลังเติบโต

 

5.การดำเนินการซ้ำ (เป็นรอบ) ในการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็ง- (SPPS)

กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับทำซ้ำวงจรการปลดการป้องกัน → การมีเพศสัมพันธ์ → การซัก, เพิ่มกรดอะมิโนหนึ่งตัวต่อรอบเพื่อค่อยๆยืดสายโซ่เปปไทด์ให้ยาวขึ้น หลังละปฏิกิริยาการมีเพศสัมพันธ์เรซินก็คือล้าง(เช่น ด้วยตัวทำละลาย เช่น DMF หรือ DCM) เพื่อกำจัดรีเอเจนต์ที่ไม่ทำปฏิกิริยา ผลพลอยได้- และกรดอะมิโนส่วนเกิน ที่-กลุ่มอะมิโนของเรซิดิวที่เพิ่มเข้ามาใหม่จะถูกยกเลิกการป้องกันเผยให้เห็นเอมีนอิสระเพื่อเตรียมสำหรับปฏิกิริยาคัปปลิ้งถัดไป วงจรนี้จะถูกทำซ้ำจนกระทั่งลำดับเปปไทด์ที่ต้องการถูกประกอบอย่างสมบูรณ์

 

6.การแตกแยกใน-การสังเคราะห์เฟสเปปไทด์ที่เป็นของแข็ง (SPPS)

เมื่อสายโซ่เปปไทด์ได้ความยาวตามที่ต้องการแล้วแยกออกจากการสนับสนุนที่มั่นคงโดยใช้รีเอเจนต์ที่เหมาะสมในขณะเดียวกันลบกลุ่มปกป้องทั้งหมด. รีเอเจนต์สำหรับการตัดแยกที่ใช้กันทั่วไปคือกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA)ซึ่งไม่เพียงเท่านั้นทำลายพันธะระหว่างเปปไทด์และเรซินแต่ยังลบกลุ่มปกป้องเช่น Fmoc และ Boc คืนเปปไทด์ให้กลับคืนสู่สภาพเดิมรัฐกำเนิด. เมื่อสายโซ่เปปไทด์ได้ความยาวตามที่ต้องการแล้วแยกออกจากการสนับสนุนที่มั่นคงโดยใช้รีเอเจนต์ที่เหมาะสมในขณะเดียวกันลบกลุ่มปกป้องทั้งหมด. รีเอเจนต์สำหรับการตัดแยกที่ใช้กันทั่วไปคือกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA)ซึ่งไม่เพียงเท่านั้นทำลายพันธะระหว่างเปปไทด์และเรซินแต่ยังลบกลุ่มปกป้องเช่น Fmoc และ Boc คืนเปปไทด์ให้กลับคืนสู่สภาพเดิมรัฐกำเนิด.

โดยผ่านขั้นตอนเหล่านี้การสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง (SPPS)ช่วยให้การประกอบโซ่เปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพและควบคุมได้บนส่วนรองรับที่มั่นคงหลีกเลี่ยงขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นกลางที่ซับซ้อนซึ่งจำเป็นในโซลูชันแบบเดิม-การสังเคราะห์เฟสและที่สำคัญปรับปรุงประสิทธิภาพการสังเคราะห์และผลผลิต.

โดยผ่านขั้นตอนเหล่านี้การสังเคราะห์เพปไทด์เฟสที่เป็นของแข็ง (SPPS)ช่วยให้การประกอบโซ่เปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพและควบคุมได้บนส่วนรองรับที่มั่นคงหลีกเลี่ยงขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นกลางที่ซับซ้อนซึ่งจำเป็นในโซลูชันแบบเดิม-การสังเคราะห์เฟสและที่สำคัญปรับปรุงประสิทธิภาพการสังเคราะห์และผลผลิต.