กระบวนการเข้มข้นของการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน/ไดอะฟิลเตรชันขั้นปลาย: วิธีการป้องกันการซึมผ่านและการสูญเสียโปรตีนเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพ

กระบวนการความเข้มข้นของการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน/ไดฟิลเตรชันขั้นปลาย: วิธีป้องกันการซึมผ่านและการสูญเสียโปรตีนเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพ

ในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นปลายน้ำสำหรับโปรตีนลูกผสม ผลิตภัณฑ์จากเลือด และชีววิทยาอื่นๆ อัลตราฟิลเตรชัน/ไดฟิลเตรชัน (UF/DF) ใช้สำหรับความเข้มข้นของวัตถุดิบตั้งต้น การแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ และการกำจัดเกลือและสิ่งเจือปน{0}}โมเลกุลขนาดเล็ก การแยกทำได้โดยอาศัยการกรองเมมเบรน: โมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAbs) จะถูกเก็บรักษาไว้โดยเมมเบรน ในขณะที่เกลือ เอนโดทอกซิน โปรตีนเซลล์เจ้าบ้านอิสระ (HCP) และสิ่งสกปรกโมเลกุลขนาดเล็ก-อื่นๆ จะผ่านเมมเบรนและถูกกำจัดออกไปในเปอร์มีเอต ในระหว่างกระบวนการขยายขนาด- การสูญเสียโปรตีนเป้าหมายผ่านเมมเบรนสามารถเกิดขึ้นได้ทันที ซึ่งช่วยลดผลผลิตโดยตรงและเพิ่มต้นทุนแบทช์ ในบางสภาวะการทำงาน โปรตีนอาจถูกตรวจพบในเพอร์มีเอต โดยต้องมีการพิจารณาอย่างรวดเร็วว่าส่วนประกอบที่รั่วไหลนั้นเป็น mAb เป้าหมายที่สมบูรณ์ มวลรวมที่เสื่อมสลาย/กระจัดกระจาย หรือโปรตีนเซลล์เจ้าบ้าน บทความนี้แบ่งออกเป็นสองส่วนหลัก: ทบทวนแนวทางการควบคุมกระบวนการ-แบบดั้งเดิม และเมื่อรวมกับการออกแบบการทดลอง (DOE) จะสร้างกรอบกระบวนการที่แข็งแกร่ง ซึ่งได้รับการสนับสนุนโดยวิธีการวิเคราะห์หลายวิธีเพื่อระบุลักษณะเฉพาะของโปรตีนที่ตรวจพบในเพอร์มีเอต

 

 

I. สาเหตุหลักของการซึมผ่านของโปรตีนเป้าหมายผ่านเมมเบรนระหว่าง UF/DF

1. แรงดันเมมเบรนมากเกินไป (TMP)
เมื่อความแตกต่างของความดันทั่วทั้งเมมเบรนสูงเกินไป การลากตัวทำละลายจะเพิ่มขึ้น ส่งผลให้โปรตีนโมโนเมอริกบางส่วนเข้าไปในเพอมิเอต ในระหว่างการเพิ่มขนาด- ถังป้อนอาหารจะมีปริมาณวัสดุมากขึ้น และความผันผวนของแรงดันในท่อจะเด่นชัดมากขึ้น ทำให้เกิดแรงดันเกินชั่วคราวมากกว่าในระดับห้องปฏิบัติการ

2. อัตราการไหลสัมผัสที่ไม่เหมาะสม
หากอัตราการไหลต่ำเกินไป ชั้นโพลาไรเซชันที่มีความเข้มข้น-หนาแน่นจะก่อตัวขึ้นบนพื้นผิวเมมเบรน และความเข้มข้นของโปรตีนเฉพาะที่อาจเกินขีดจำกัดความทนทานของเมมเบรน หากอัตราการไหลสูงเกินไป ความเค้นเฉือนอาจทำให้เกิดการแตกแยกทางโครงสร้างของ mAb ทำให้เกิดชิ้นส่วนโปรตีนที่มีขนาดเล็กลงซึ่งสามารถผ่านรูเมมเบรนได้อย่างอิสระ

3. ความเข้มข้นของโปรตีนสูงเกินไปในวัตถุดิบตั้งต้น
เมื่อความเข้มข้นของโปรตีนในอาหารสูงเกินไป โปรตีนจะสะสมที่ผิวเมมเบรน และโปรตีนโมโนเมอริกบางส่วนอาจถูกพาเข้าไปในเพอมีเอต นี่เป็นปัญหาทั่วไปใน-การผลิตขนาดใหญ่

4. ค่า pH หรือค่าการนำไฟฟ้าอยู่นอกช่วงกระบวนการ
การเปลี่ยนแปลงลักษณะประจุของโปรตีนสามารถลดรัศมีความชุ่มชื้นและขนาดอนุภาคที่ปรากฏ ส่งผลให้เกิดการซึมผ่านของเมมเบรนที่ผิดปกติ

5. เมมเบรนคาสเซ็ตมีอายุมากขึ้น ฟลักซ์แพร่กระจายสูง หรือการปรับสภาพล่วงหน้า-ไม่เพียงพอ
ข้อบกพร่องทางกายภาพในตลับเมมเบรนสามารถทำให้เกิดการรั่วไหลของโปรตีนได้โดยตรง และแสดงถึงความเสี่ยงที่เกี่ยวข้องกับอุปกรณ์- CIP ซ้ำๆ กับสารละลายที่มีความเป็นด่างสูงสามารถค่อยๆ สร้างความเสียหายให้กับวัสดุเมมเบรนโพลีเอเทอร์ซัลโฟน (PES) ได้

6. ปริมาณการกรองที่มากเกินไป
ในระหว่างการกรองไดอะฟิลเตรชันเป็นเวลานาน การชะล้างตัวทำละลายอย่างต่อเนื่องสามารถค่อยๆ นำโปรตีนโมโนเมอร์จำนวนเล็กน้อยออกไป

 

ครั้งที่สอง มาตรการปฏิบัติแบบดั้งเดิมเพื่อป้องกันการซึมผ่านและการสูญเสียโปรตีนเป้าหมาย

(A) การควบคุมพารามิเตอร์กระบวนการ

1. ควบคุมแรงดันเมมเบรน (TMP)
กำหนดขีดจำกัดการเตือนแรงดันด้านบนและสร้างสัญญาณเตือนแบบอินเทอร์ล็อกเพื่อป้องกันแรงดันสูง-กระทบต่อชั้นเมมเบรนชั่วคราว หลังจากกำหนดพารามิเตอร์พื้นฐานในระดับเล็กแล้ว ให้ลดแรงกดดันในการทำงานที่ปลอดภัยระหว่าง-เพิ่มการผลิต และสำรองช่วงที่ยอมรับได้ของกระบวนการที่เหมาะสม

2. ปรับอัตราการไหลข้ามให้เหมาะสม
สร้างชั้นขอบเขตที่มั่นคงและลดโพลาไรเซชันของความเข้มข้นที่พื้นผิวเมมเบรนผ่านการไหลข้าม ซึ่งช่วยลดการสะสมโปรตีนบนพื้นผิวเมมเบรนที่แหล่งกำเนิด

3. จำกัดความเข้มข้นสุดท้ายหลังจากความเข้มข้น
กำหนดขีดจำกัดความเข้มข้นตามคุณสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ของโปรตีน และหลีกเลี่ยงความเข้มข้นของอาหารมากเกินไป สำหรับ mAbs ความเข้มข้นสุดท้ายตามปกติโดยทั่วไปจะไม่เกิน 50 มก./มล. สำหรับการรวมตัว- mAbs ที่มีแนวโน้มที่จะรวมกลุ่มบางอย่าง ความเข้มข้นควรลดลงอีก

4. ควบคุมค่า pH และการนำไฟฟ้าของฟีด
รักษาขนาดอนุภาคไฮเดรดของโปรตีนให้คงที่ และหลีกเลี่ยงการหดตัวของโมเลกุลที่เกิดจากการรบกวนของความเข้มข้นของกรด/เบสหรือไอออนิก{0}}

(B) อุปกรณ์และการควบคุมการปฏิบัติงาน

1. ทำการทดสอบความสมบูรณ์ของตลับเมมเบรนก่อนแต่ละชุด
ทำการทดสอบจุดฟอง-ก่อนการผลิตแต่ละชุดเพื่อระบุเส้นใยเมมเบรนที่แตกหัก ควรทิ้งตลับเมมเบรนที่เสียหายทันทีเพื่อป้องกันการรั่วไหลของโปรตีนอย่างต่อเนื่อง

2. สร้างมาตรฐานขั้นตอนการทำความสะอาด CIP
ควบคุมความเข้มข้นของ NaOH และเวลาสัมผัส หลังจากการทำความสะอาดที่มีฤทธิ์เป็นด่างสูง ให้ปรับวัสดุเมมเบรนให้สมดุลเต็มที่เพื่อลดความเสี่ยงที่จะเกิดการเสียรูปของรูพรุนของเมมเบรน

3. ใช้การกรองแบบแบ่งขั้นตอน
ใช้การแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ในปริมาณมาก-ในระหว่างระยะแรกเพื่อกำจัดเกลือ และชะลออัตราการไหลของไดอะฟิลเตรชันเมื่อจุดสิ้นสุดเข้าใกล้เพื่อลดการลากและการสูญเสียโปรตีน

 

III. การสร้างพื้นที่การออกแบบกระบวนการผ่าน DOE (การระบุคุณลักษณะของกระบวนการ QbD; ใช้ได้กับการส่ง IND)

1. การคัดกรองปัจจัย
คัดกรองพารามิเตอร์กระบวนการ UF/DF หลัก 5 ประการ (P): ความดันเมมเบรน อัตราการไหลของสารป้อน ความเข้มข้นของโปรตีนเริ่มต้น ค่า pH ของสารป้อน และอุณหภูมิในการทำงาน
ตัวแปรการตอบสนอง: ผลผลิตที่คงไว้ ปริมาณโปรตีนในเพอมีเอต ฟลักซ์ของเมมเบรน และเปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักรวม-โมเลกุล-สูง

ระบุปัจจัยสำคัญที่มีส่วนทำให้เกิดการรั่วไหลของโปรตีนผ่านการวิเคราะห์ที่มีนัยสำคัญ

2. การสร้างแบบจำลองพื้นผิวตอบสนอง
เลือกพารามิเตอร์สี่ตัวที่มีความสำคัญสูงสุดเพื่อสร้างพื้นผิวการตอบสนองและวิเคราะห์การโต้ตอบระหว่างพารามิเตอร์ ภายใต้สภาวะการทำงานหลายๆ พารามิเตอร์ พารามิเตอร์ตัวเดียวอาจยังคงอยู่ในช่วงที่ผ่านการรับรอง ในขณะที่การรวมกันของพารามิเตอร์สองตัวอาจส่งผลให้เกิดการซึมผ่านของโปรตีน ผลกระทบจากการโต้ตอบดังกล่าวไม่สามารถระบุได้ด้วยการทดสอบ-ปัจจัย-แบบเดิมในเวลา-ต่อ- ตามแบบจำลอง ให้กำหนดพื้นที่การออกแบบที่ใช้งานได้ ตราบใดที่พารามิเตอร์กระบวนการยังคงอยู่ในช่วงนี้ สามารถรับประกันการกักเก็บโปรตีนที่มีประสิทธิผลได้ในขณะที่สิ่งเจือปนถูกกำจัดออกโดยการกรองแบบไดฟิลเตรชัน

3. ความท้าทายกรณีที่แย่ที่สุด- (จำเป็นสำหรับการระบุลักษณะกระบวนการ)
เลือกพารามิเตอร์กระบวนการที่ขอบสุดของขอบเขตการปฏิบัติงานเพื่อจำลองความแปรปรวนในการผลิต: TMP สูงสุด อัตราการไหลข้ามขั้นต่ำ และ-ขีดจำกัดบนของความเข้มข้นของโปรตีน ตรวจสอบว่าแม้ภายใต้สภาวะการทำงานที่หนักหน่วง การสูญเสียโปรตีนเป้าหมายขนาดใหญ่-จะไม่เกิดขึ้น ดังนั้นจึงเป็นไปตามข้อกำหนดการตรวจสอบของ CMC

 

IV. วิธีการวิเคราะห์หลายวิธีเพื่อระบุโปรตีนที่ตรวจพบใน mAb เป้าหมายที่แทรกซึมและแยกแยะ ชิ้นส่วนการย่อยสลาย และ HCP

ขึ้นอยู่กับประสิทธิภาพในการวิเคราะห์ ต้นทุน และสถานการณ์การยื่นตามกฎระเบียบ วิธีการสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภท: การคัดกรองอย่างรวดเร็วและการทดสอบเพื่อยืนยัน ควรจัดลำดับความสำคัญของวิธีการที่รวดเร็วสำหรับการตรวจสอบกระบวนการตามปกติ เมื่อเกิดการเบี่ยงเบนผิดปกติ ควรใช้วิธีการระบุที่แม่นยำ

1. UV spectrophotometry (การคัดกรองออนไลน์อย่างรวดเร็ว เหมาะสำหรับร้านค้าทั่วไป-การตรวจสอบพื้น)
รวบรวมเพอมีเอตและวัดการดูดกลืนแสง A280 วิธีนี้สามารถระบุได้ว่ามีโปรตีนอยู่ในเพอร์มีเอตหรือไม่ และไม่สามารถแยกแยะชนิดของโปรตีนได้ ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการตรวจสอบกระบวนการตามปกติ ค่า A280 ที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องบ่งชี้ว่าการรั่วไหลของโปรตีนแย่ลง และจำเป็นต้องระงับการกรองแบบไดฟิลเตรชันทันทีและการตรวจสอบกระบวนการ

2. SDS-PAGE electrophoresis (วิธีการระบุเชิงคุณภาพที่ใช้กันมากที่สุด)
ใช้อิเล็กโตรโฟเรซิสแบบรีดิวซ์และไม่รีดิวซ์- และเปรียบเทียบตำแหน่งของแถบความถี่กับตำแหน่งของ mAb เป้าหมายในวัตถุดิบตั้งต้น:
1) หากตำแหน่งของย่านความถี่สอดคล้องกับ mAb เป้าหมายอย่างสมบูรณ์ แสดงว่า mAb ที่สมบูรณ์ได้แทรกซึมเข้าไปในเมมเบรนแล้ว
2) หากแถบน้ำหนัก-โมเลกุล-ต่ำกว่าปรากฏขึ้น แสดงว่าโปรตีนนั้นผ่านกระบวนการแยกไฮโดรไลติก ทำให้เกิดชิ้นส่วน mAb
3) หากแถบกระจายด้วยแถบเบ็ดเตล็ดหลายแถบ ส่วนใหญ่เป็นโปรตีนเซลล์เจ้าบ้าน (HCP) จากเซลล์เจ้าบ้าน E. coli/CHO แทนที่จะเป็นผลิตภัณฑ์เป้าหมาย

3. โครมาโทกราฟีแบบแยก (HPSEC) ขนาดประสิทธิภาพสูง-
แยกส่วนประกอบตามขนาดโมเลกุล และเปรียบเทียบเวลาการชะกับส่วนประกอบของโครมาโตกราฟีวัตถุดิบ:
- พีคหลักที่มีเวลาคงค้างเท่ากับ mAb บ่งชี้ถึงโปรตีนเป้าหมายที่สมบูรณ์
- การชะล้างจุดสูงสุดก่อนหน้านี้บ่งบอกว่า-มวลรวม/ชิ้นส่วนของน้ำหนักโมเลกุลสูง
- การชะล้างจุดสูงสุดในภายหลังบ่งชี้ว่าชิ้นส่วนการย่อยสลายน้ำหนักโมเลกุลต่ำ-
- การไม่มีพีคหลักที่มีลักษณะเฉพาะบ่งชี้ถึงโปรตีนที่ไม่บริสุทธิ์ของ HCP
วิธีนี้สามารถให้ข้อมูลเชิงปริมาณและสามารถรวมอยู่ในรายงานการตรวจสอบความเบี่ยงเบนของกระบวนการ ได้รับการยอมรับอย่างสูงในการยื่นเอกสารทางคลินิก

4. การทดสอบชุด ELISA โปรตีนของเซลล์โฮสต์ HCP-
หากตรวจพบโปรตีนในเพอร์มีเอต ผลลัพธ์ของ ELISA จะเพิ่มขึ้น และ HPSEC ไม่แสดงจุดสูงสุดของ mAb ที่มีลักษณะเฉพาะ โดยทั่วไปแล้ววัสดุที่รั่วไหลสามารถระบุได้ว่าเป็นโปรตีนของเซลล์เจ้าบ้าน CHO- สิ่งนี้บ่งชี้ว่าการกำจัดสิ่งเจือปนที่ไม่สมบูรณ์ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ขั้นต้นน้ำ สิ่งเจือปนจะถูกชะล้างออกไปในระหว่างขั้นตอน UF/DF และไม่ได้แสดงถึงการสูญเสียผลิตภัณฑ์

5. การตรวจสอบ Affinity chromatography (โครมาโตกราฟีโปรตีน A)
โปรตีน A จับบริเวณ Fc ของ mAbs อย่างจำเพาะ ใส่ตัวอย่างเพอมิเอตลงในคอลัมน์: การปรากฏตัวของจุดชะล้างที่มีลักษณะเฉพาะบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของแอนติบอดีเป้าหมายที่ครบถ้วน การไม่มีจุดสูงสุดของการชะล้างแสดงให้เห็นว่าโปรตีนในเพอมิเอตนั้นเป็นโปรตีนที่ไม่บริสุทธิ์ทั้งหมด

6. แมสสเปกโตรเมทรี (LC-MS) (ใน-การตรวจสอบย้อนกลับเชิงลึก ใช้สำหรับการตรวจสอบความเบี่ยงเบนที่สำคัญของกระบวนการ)
LC-MS สามารถวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนได้โดยตรงและระบุที่มาของโปรตีนได้อย่างแม่นยำ ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการตรวจสอบการเบี่ยงเบนที่ยากหรือผิดปกติ และไม่ได้ใช้เป็นประจำใน-การทดสอบการควบคุมกระบวนการ

V. การดำเนินการแก้ไขที่สอดคล้องกับผลลัพธ์การวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน

1. ตรวจพบ mAb เป้าหมายที่สมบูรณ์ในเพอร์มีเอต
ลดความดันของเมมเบรนและความเข้มข้นสุดท้ายหลังจากความเข้มข้น จำกัดช่วงการทำงานของกระบวนการให้แคบลงโดยพิจารณาจากผลลัพธ์ของ DOE และตรวจสอบความสมบูรณ์ของตลับเมมเบรน

2. ตรวจพบชิ้นส่วนการย่อยสลายของแอนติบอดีในเพอมิเอต
ตรวจสอบความเค้นเฉือนตลอดกระบวนการและค่า pH สุดขั้ว ปรับขั้นตอนการยับยั้งไวรัสต้นน้ำให้เหมาะสมเพื่อลดความแตกแยกของโปรตีน

3. ตรวจพบเฉพาะโปรตีนเจือปน HCP ในเพอร์มีเอต
ไม่จำเป็นต้องปรับพารามิเตอร์ UF/DF ติดตามปัญหากลับไปยังขั้นตอนโครมาโทกราฟีก่อนหน้านี้ และปรับปรุงการกำจัดสิ่งเจือปนในระหว่างความสัมพันธ์และโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน-

 

วี. สรุป

เพื่อป้องกันการรั่วไหลของโปรตีนในระหว่าง UF/DF การควบคุมกระบวนการแบบดั้งเดิมอาศัยประสบการณ์ในอดีตเพื่อกำหนดพารามิเตอร์แต่ละจุด ซึ่งสามารถจัดการกับการผลิตขนาดเล็ก-ที่มีความเสถียรได้อย่างเพียงพอเท่านั้น เพื่อให้มั่นใจถึงประสิทธิภาพที่เสถียรระหว่างการขยายขนาดกระบวนการแบบเป็นขั้นตอน- ควรใช้การกำหนดลักษณะเฉพาะของกระบวนการตาม DOE- เพื่อสร้างพื้นที่การออกแบบกระบวนการที่มีความทนทานเพียงพอ การควบคุมพารามิเตอร์ตามช่วงเวลา-สามารถชดเชยความแปรปรวนในการผลิตได้ เมื่อตรวจพบโปรตีนในเพอร์มีเอต ระบบตรวจจับ UV แบบธรรมดาสามารถแจ้งเตือนเบื้องต้นได้ ตามด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิส, HPSEC และ ELISA เพื่อการตรวจสอบย้อนกลับและการระบุตัวตน ซึ่งช่วยให้สามารถแยกแยะความแตกต่างได้อย่างแม่นยำระหว่างผลิตภัณฑ์เป้าหมายและโฮสต์-สิ่งเจือปนของเซลล์ ซึ่งช่วยให้รากที่เป็นเป้าหมาย-สามารถตรวจสอบและดำเนินการแก้ไขได้ นี่ยังเป็นองค์ประกอบการวิจัยที่เป็นมาตรฐานซึ่งปัจจุบันรวมอยู่ในเอกสาร CMC สำหรับโครงการ mAb