การทำให้บริสุทธิ์ของแบคทีเรียในขั้นตอนปลายน้ำระดับอุตสาหกรรม- — ส่วน 'การทำให้กระจ่าง' และ 'อัลตราฟิลเตรชัน'

แบคทีเรียหรือที่เรียกว่าฟาจเป็นไวรัสที่ติดเชื้อแบคทีเรีย ฟาจไม่สามารถอยู่รอดได้ด้วยตัวเอง มันจะต้องปรสิตแบคทีเรียโฮสต์เพื่อสืบพันธุ์ ซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะทำให้แบคทีเรียสลายตัว เนื่องจากคุณสมบัติเฉพาะตัว ฟาจจึงสามารถนำไปใช้ทางคลินิกเพื่อระบุและพิมพ์ประเภทของแบคทีเรีย รวมถึงการรักษาโรคติดเชื้อแบคทีเรียที่ดื้อต่อยาบางชนิดได้

นี่คือแผนผังของโครงสร้างแบคทีริโอฟาจ (แหล่งรูปภาพ: อินเทอร์เน็ต)

 

มีการประเมินว่าโรคพืชทำให้เกิดการสูญเสียผลผลิตพืชผลทั่วโลกมากกว่า 30% ในแต่ละปี ในบรรดาเชื้อโรคต่างๆ โรคจากแบคทีเรียนั้นควบคุมได้ยากเป็นพิเศษ วิธีการควบคุมแบบดั้งเดิมส่วนใหญ่อาศัยยาปฏิชีวนะและสารที่มีทองแดง- อย่างไรก็ตาม การใช้ยาปฏิชีวนะมากเกินไปทำให้เกิดการดื้อยาต้านจุลชีพที่รุนแรงมากขึ้น ในขณะที่การใช้สารประกอบทองแดง-ในระยะยาวส่งผลให้เกิดการสะสมในสิ่งแวดล้อม ซึ่งก่อให้เกิดความเสี่ยงต่อสุขภาพของมนุษย์และสัตว์

 

เนื่องจากแบคทีริโอฟาจมีความจำเพาะสูง จึงสามารถเลือกฆ่าเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคได้โดยไม่ทำอันตรายต่อจุลินทรีย์ที่เป็นประโยชน์หรือเซลล์เจ้าบ้านอื่นๆ ดังนั้น ฟาจจึงเป็นทางเลือกแทนยาปฏิชีวนะและสารที่มีทองแดง- ด้วยการบำบัดด้วยฟาจ เชื้อโรคสามารถกำจัดได้อย่างมีประสิทธิภาพในขณะที่ลดการใช้ยาปฏิชีวนะและสารประกอบทองแดง

 

ด้วยความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีอย่างต่อเนื่อง และการวิจัยเชิงลึกเกี่ยวกับแบคทีริโอฟาจ โอกาสในการใช้ฟาจในการรักษาซูเปอร์บักจึงมีแนวโน้มเพิ่มมากขึ้น ในอนาคต การบำบัดด้วยฟาจคาดว่าจะกลายเป็นหนึ่งในวิธีแก้ปัญหาสำคัญในการดื้อยาปฏิชีวนะ จากการวิจัยและการสำรวจอย่างต่อเนื่อง การบำบัดด้วยฟาจอาจกลายเป็นกำลังสำคัญในด้านการบำบัดด้วยยาต้านจุลชีพ ซึ่งส่งผลดีต่อสุขภาพของมนุษย์มากขึ้น

 

อย่างไรก็ตาม เพื่อให้สามารถจัดการแบคทีริโอฟาจในร่างกายมนุษย์ได้อย่างปลอดภัยและมีประสิทธิภาพ-โดยเฉพาะอย่างยิ่งผ่านการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ (IV)- ความท้าทายที่สำคัญประการหนึ่งยังคงอยู่:วิธีรับการเตรียมฟาจบริสุทธิ์พิเศษ-.

ฟาจไลเซตเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อน ซึ่งนอกเหนือจากฟาจเป้าหมายแล้ว ยังมีสิ่งเจือปนที่สำคัญ เช่น แบคทีเรียโฮสต์และชิ้นส่วนของพวกมัน DNA จีโนม และโปรตีนโฮสต์ (สิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องกับโฮสต์{{0}) เอนโดทอกซิน เช่น ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS) (กระบวนการ-สิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการ); และสิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องกับผลิตภัณฑ์- รวมถึงฝาปิดที่ว่างเปล่าและส่วนหางที่หัก

ดังนั้น เป้าหมายของการทำให้บริสุทธิ์จึงไม่เพียงแต่เพื่อให้ได้ฟาจไทเตอร์ที่สูงเท่านั้น แต่ยังช่วยลดสิ่งเจือปน-โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอนโดทอกซิน, DNA ของโฮสต์ และโปรตีน-ให้อยู่ในระดับที่ต่ำมากตามที่ระบุไว้ในมาตรฐานเภสัชตำรับ

โดยทั่วไปกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยฟาจที่มีประสิทธิภาพและปรับขนาดได้จะเป็นไปตามหลักการทั่วไปของการประมวลผลขั้นปลายและสามารถแบ่งออกเป็นขั้นตอนเชิงตรรกะต่อไปนี้:

กระบวนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นปลายของแบคทีเรีย

 

การทำให้กระจ่าง – การกำจัดสิ่งเจือปนด้วยตาเปล่า

ในระยะเริ่มแรกของการทำให้บริสุทธิ์ด้วยแบคทีเรีย เป้าหมายหลักของขั้นตอนการทำให้กระจ่างคือการกำจัดเซลล์แบคทีเรียที่ไม่บุบสลายและเศษเซลล์ขนาดใหญ่ออกจากไลเซตดิบอย่างมีประสิทธิภาพ วัตถุประสงค์หลักของขั้นตอนนี้คือเพื่อให้ฟีดที่สะอาดสำหรับคอลัมน์โครมาโทกราฟีดาวน์สตรีมหรือหน่วยแยกเมมเบรน เพื่อลดภาระของอนุภาคของแข็งให้เหลือน้อยที่สุด ซึ่งจะช่วยป้องกันการอุดตันในหน่วยการทำให้บริสุทธิ์ครั้งต่อไปได้อย่างมีประสิทธิภาพ ช่วยให้มั่นใจถึงการทำงานที่มั่นคงและประสิทธิภาพของกระบวนการสูงตลอดขั้นตอนการทำงานการทำให้บริสุทธิ์

ในกระบวนการขั้นปลายน้ำของแบคเทอริโอฟาจแบบดั้งเดิม การชี้แจงโดยทั่วไปอาศัย-การหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำรวมกับ-การกรองเชิงลึกหลายขั้นตอน- โดยทั่วไปจะผ่านตัวกรอง 0.8μm, 0.45μm และ 0.22μm ตามลำดับ- เพื่อกำจัดเศษเซลล์โฮสต์และสิ่งสกปรกอย่างมีประสิทธิภาพ แม้ว่าจะมีความเป็นผู้ใหญ่และเชื่อถือได้ แต่แนวทางนี้เกี่ยวข้องกับหลายขั้นตอน ใช้เวลานาน- และต้องมีการถ่ายโอนวัสดุซ้ำๆ เหลือพื้นที่สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพในด้านผลผลิตและประสิทธิภาพโดยรวม

 

แทนที่การกรองเชิงลึกหลาย-ด้วยแคปซูลกรองไมโครสามารถทำให้กระบวนการง่ายขึ้นและเข้มข้นขึ้นอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง หลังจากกำจัดเศษเซลล์ส่วนใหญ่ออกด้วยการหมุนเหวี่ยงความเร็วต่ำ- ไลซีนสามารถประมวลผลได้โดยตรงโดยการกรองการไหลแบบสัมผัส (TFF)ใช้แคปซูลกรองไมโครที่มีขนาดรูพรุนที่กำหนดไว้ (0.45μm หรือ 0.22μm) ซึ่งช่วยให้สามารถขจัดสิ่งเจือปนที่เป็นอนุภาคได้อย่างละเอียดและการซึมผ่านของฟาจเป้าหมายใน a ได้อย่างมีประสิทธิภาพขั้นตอนเดียวผสมผสานการกรองสามขั้นตอนการดั้งเดิมเข้าไว้ด้วยกันอย่างมีประสิทธิภาพ

นวัตกรรมนี้ไม่เพียงแต่ช่วยลดเวลาการทำงานและการจัดการด้วยตนเองลงอย่างมาก แต่ยังลดการสูญเสียตัวอย่างและความเสี่ยงในการปนเปื้อนที่เกิดจากขั้นตอนการกรองหลายขั้นตอน จึงช่วยปรับปรุงการนำฟาจกลับมาใช้ใหม่โดยรวม ในขณะเดียวกัน การดำเนินการไหลในแนวสัมผัสช่วยลดการเปรอะเปื้อนของเมมเบรน เพิ่มปริมาณงาน และเพิ่มความแข็งแกร่งของกระบวนการ

 

ดังนั้นการนำเอากลยุทธ์การทำให้กระจ่างแบบบูรณาการที่ผสมผสาน-การปั่นเหวี่ยงความเร็วต่ำและแคปซูลกรองละเอียดเข้าด้วยกันแสดงถึงแนวทางที่มีประสิทธิผลในการปรับปรุงประสิทธิภาพและ-ประสิทธิผลด้านต้นทุนของการผลิตแบคทีเรียฟาจขนาดใหญ่- โดยทั่วไปแล้ว แคปซูลกรองละเอียดของ Guidling Technology สามารถลดความขุ่นของฟีดลงได้ต่ำกว่าปกติ20 นิวตันยูเนี่ยนเป็นไปตามข้อกำหนดของขั้นตอนอัลตราฟิลเตรชันและโครมาโตกราฟีที่ตามมาอย่างสมบูรณ์

 

การดักจับและความเข้มข้น – การทำให้บริสุทธิ์ขั้นต้นและการลดปริมาตร

ในระหว่างการจับและความเข้มข้นขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์จากแบคทีริโอฟาจ วัตถุประสงค์หลักคือเพื่อนำฟาจกลับมาใช้ใหม่อย่างมีประสิทธิภาพจากไลซีนที่ทำให้ใสในปริมาณมาก ขณะเดียวกันก็ได้ความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์หลักและการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ไปพร้อมๆ กัน ขั้นตอนนี้ขึ้นอยู่กับเป็นหลักการกรองการไหลแบบสัมผัส (TFF)เทคโนโลยี.

 

หลักการของ TFF อยู่ที่การใช้เมมเบรนอัลตราฟิลเตรชันที่มีการตัดน้ำหนักโมเลกุลจำเพาะ- (โดยทั่วไปคือ 100 หรือ 300kDa) สิ่งเจือปนระดับโมเลกุลขนาดเล็ก เช่น ส่วนประกอบของสื่อการเพาะเลี้ยงที่ตกค้าง สารเมตาบอไลต์ และโปรตีนขนาดเล็ก คัดเลือกผ่านรูพรุนของเมมเบรน ในขณะที่ฟาจยังคงอยู่ในรีเทนเทตเนื่องจากเอฟเฟกต์การยกเว้นขนาดช่วยให้สามารถแยกและเพิ่มคุณค่าได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ภายในระบบ TFFโหมดการกรองแบบพิเศษถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของปริมาตรในขณะที่เปลี่ยนไปใช้โหมดการกรองช่วยให้มีการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์ จึงสร้างสภาวะทางเคมีกายภาพที่เหมาะสมสำหรับขั้นตอนต่อๆ ไป เช่น การบำบัดด้วยเอนไซม์

เทคโนโลยีนี้มีข้อดีรวมกันของประสิทธิภาพการประมวลผลสูงและความสามารถในการขยายขนาดที่ดีเยี่ยมทำให้เหมาะสำหรับการผลิตขนาดใหญ่- จากข้อมูลของ GuidlingTechnology แคปซูลอัลตราฟิลเตรชันมักจะบรรลุอัตราการฟื้นตัวของฟาจ 90–95%ขึ้นอยู่กับวัสดุเฉพาะที่กำลังดำเนินการ

 

การทำให้บริสุทธิ์อย่างล้ำลึก – การกำจัดสิ่งเจือปนที่สำคัญอย่างตรงเป้าหมาย

ในการทำให้บริสุทธิ์จากแบคทีเรียการทำให้บริสุทธิ์อย่างล้ำลึกเป็นขั้นตอนสำคัญที่กำหนดคุณภาพผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย เป้าหมายหลักคือการกำจัดสิ่งสกปรกที่สำคัญโดยเฉพาะเช่น สารเอนโดทอกซิน แบบดั้งเดิมการปั่นแยกด้วยเกรเดียนต์ของความหนาแน่น CsCl-เนื่องจากความเป็นพิษและการขาดความสามารถในการปรับขนาด-จึงถูกกำจัดออกจากกระบวนการทางอุตสาหกรรม แนวทางปัจจุบันมุ่งเน้นไปที่เทคโนโลยีที่ใช้โครมาโตกราฟี-ด้วยการบูรณาการนวัตกรรมของการปรับสภาพเอนไซม์.

 

การผสมผสานกลยุทธ์ขั้นสูงโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุลบ (AEC)กับการปรับสภาพด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (AP)ได้รับการพัฒนา ทั้งฟาจและไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS) มีประจุลบ ซึ่งนำไปสู่การแข่งขันสำหรับตำแหน่งการจับกันในกระบวนการ AEC แบบเดิมๆ และทำให้เกิดการชะล้างร่วม-ที่ลดประสิทธิภาพในการทำให้บริสุทธิ์ ด้วยการแนะนำการปรับสภาพ AP ก่อนที่จะโหลด AEC เอนไซม์จะกำจัดกลุ่มฟอสเฟตออกจากไขมัน A และบริเวณแกนโพลีแซ็กคาไรด์ของโมเลกุล LPS โดยเฉพาะ ซึ่งจะช่วยลดประจุลบสุทธิของพวกมันได้อย่างมาก สิ่งนี้ทำให้ความสัมพันธ์ระหว่างพวกมันกับตัวกลางแลกเปลี่ยนประจุลบลดลงอย่างมีประสิทธิภาพ

ข้อมูลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการรักษาตัวอย่างด้วย20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร APตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ตัวดูดซับเมมเบรนลิแกนด์ควอเทอร์นารีเอมีน (Q) หรือคอลัมน์เสาหินสามารถบรรลุถึงกำจัดเอนโดท็อกซินได้ 98.8%ขณะเดียวกันก็รักษาอัตราการนำฟาจกลับคืนมาได้อย่างดีเยี่ยม วิธีการนี้สามารถแก้ไขปัญหา-ปัญหาการดูดซับร่วมของเอนโดท็อกซิน-ที่มีมายาวนานในระหว่างการทำให้ฟาจบริสุทธิ์ได้สำเร็จ

การขัด – การปรับแต่งและการกำหนดสูตรขั้นสุดท้าย

 

ในรอบสุดท้ายขั้นตอนการขัดวัตถุประสงค์หลักคือการบรรลุความบริสุทธิ์สูงสุดและความพร้อมในการกำหนดสูตร ซึ่งรวมถึงการขจัดสิ่งเจือปนที่ตกค้าง การกำจัดสารเติมแต่งที่นำมาใช้ในระหว่างกระบวนการ (เช่น อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส) และการแลกเปลี่ยนผลิตภัณฑ์ทั้งหมดเป็นระบบบัฟเฟอร์ที่เข้ากันได้ของสูตร-

โดยทั่วไปจะสำเร็จได้โดยผ่านการกรองทุติยภูมิซึ่งเป็นวิธีการที่ได้รับการพิสูจน์แล้วและมีประสิทธิภาพซึ่งช่วยให้สามารถกำจัดสิ่งปนเปื้อนโมเลกุลขนาดเล็ก-ได้อย่างล้ำลึกและการแลกเปลี่ยนบัฟเฟอร์อย่างละเอียด

 

เพื่อเพิ่มความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ให้ดียิ่งขึ้นโครมาโทกราฟีแบบโต้ตอบด้วยพันธะไฮโดรเจน-หรือโครมาโตกราฟีโหมดผสม- (MMC)สามารถแนะนำเป็นขั้นตอนการขัดขั้นสุดท้าย- เทคนิคเหล่านี้ใช้กลไกการแยกหลายมิติเพื่อกำจัดส่วนประกอบปริมาณเล็กน้อยที่มีคุณสมบัติเคมีกายภาพคล้ายกับส่วนประกอบของฟาจเป้าหมาย ผลลัพธ์ที่ได้คือส่วนผสมทางเภสัชกรรม (API) ของแบคทีเรียที่มีความบริสุทธิ์สูง ซึ่งตรงตามมาตรฐานคุณภาพที่เข้มงวดที่จำเป็นสำหรับสูตรเกรดการฉีด-.

ด้วยการเลือกการผสมผสานระหว่างโมดูลไมโครฟิลเตรชันและโมดูลเมมเบรนอัลตราฟิลเตรชันที่มีพื้นที่เมมเบรน 1 ตร.ม. ปริมาตรสูงสุดโดยประมาณของแบคทีริโอฟาจที่สามารถแปรรูปได้สูงถึง 100 ลิตร ฟลักซ์ของวัสดุกรองไมโครฟิลเตรชันอยู่ที่ประมาณ 20–50 LMH และฟลักซ์ของวัสดุอัลตราฟิลเตรชันจะอยู่ที่ประมาณ 15–30 LMH เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการประมวลผลแบบดั้งเดิม วิธีการนี้สามารถตอบสนองความต้องการของกระบวนการทั้งสำหรับการชี้แจงและการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันได้อย่างมีประสิทธิภาพ

อ้างอิง:

ซาเวดรา และคณะการทำให้บริสุทธิ์ของสารเตรียมแบคทีริโอฟาจ (2025)

ลาปราส และคณะการหาเหตุผลเข้าข้างตนเองของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์สำหรับส่วนผสมทางเภสัชกรรมที่ออกฤทธิ์ด้วยฟาจ (2024)