ข้อควรระวังสำหรับการใช้หลอดอัลตราฟิลเตรชั่น

(1) เลือกหลอดอัลตราฟิลเตรชั่นที่เหมาะสม โดยทั่วไป น้ำหนักโมเลกุลที่จะคงไว้ไม่ควรมากกว่า 1/3 ของน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมาย ตัวอย่างเช่น ถ้าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายคือ 35kDa หลอดอัลตราฟิลเตรชันที่มีน้ำหนักโมเลกุล 10kDa สามารถเลือกได้ ถ้าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายอยู่ที่ประมาณ 10kd ก็สามารถใช้หลอดอัลตราฟิลเตรชันที่มีน้ำหนักโมเลกุล 3KD ได้ อ่านคู่มือการใช้งานอย่างระมัดระวังและให้ความสนใจกับความทนทานที่แตกต่างกันของเมมเบรนอัลตราฟิลเตรชันต่อสารเคมีต่างๆ

(2) อัลตร้าฟิลเตรชั่นที่ซื้อมาใหม่นั้นแห้ง เติมน้ำบริสุทธิ์พิเศษก่อนใช้ และน้ำจะผ่านเมมเบรนอย่างสมบูรณ์ แช่เย็นในอ่างน้ำแข็งหรือตู้เย็นสักครู่ จากนั้นเทน้ำออกแล้วเติมสารละลายโปรตีน ปริมาณที่เติมจะต้องไม่เกินเส้นสีขาวที่ด้านบนของหลอด การดำเนินการควรจะเบา ก่อนเติมสารละลายโปรตีน จะต้องใส่หลอดอัลตราฟิลเตรชั่นบนน้ำแข็งเพื่อทำให้เย็นลงก่อน

(3) ยอดคงเหลือ ทั้งมวลและจุดศูนย์ถ่วงควรมีความสมดุล โปรดทราบว่าความเร็วและความเร่งไม่ควรเร็วเกินไป มิฉะนั้น เมมเบรนอัลตราฟิลเตรชันจะเสียหายโดยตรง เริ่มการกรองด้วยอัลตร้าฟิลเตรชันแบบแรงเหวี่ยง หลังจากที่ RPM ของเครื่องหมุนเหวี่ยงต่างๆ ถูกแปลงเป็น G แล้ว ก็จะแตกต่างกัน ปรับความเร่งของเครื่องหมุนเหวี่ยงไปที่เกียร์ต่ำสุดเพื่อลดแรงกดบนเมมเบรน โปรดทราบว่าคุณต้องรอจนกระทั่งเครื่องหมุนเหวี่ยงถึงความเร็วเป้าหมายก่อนที่จะออกจากเครื่องหมุนเหวี่ยง มิฉะนั้น เมื่อมีปัญหากับเครื่องหมุนเหวี่ยง คุณจะไม่สามารถจัดการกับเครื่องหมุนเหวี่ยงได้ในครั้งแรก ทิศทางของเมมเบรนและเพลาหมุนจะต้องปรับตามคำแนะนำ (ในกรณีของการหมุนเหวี่ยงแบบหมุนมุม เมมเบรนจะตั้งฉากกับเพลา) ในการใช้งานจริง ความเร็วโดยทั่วไปจะต่ำกว่าในคู่มือ ซึ่งสามารถยืดอายุการใช้งานของท่อแบบแรงเหวี่ยงได้

(4) เมื่อเข้มข้นถึง 1 มล. ที่เหลือ ให้ใช้สารละลายบัฟเฟอร์ 50ul และเพิ่ม 10ul เพื่อไหลผ่านเพื่อดูว่าเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินหรือไม่ เพื่อตัดสินว่าหลอดอัลตราฟิลเตรชันรั่วไหลของโปรตีนหรือไม่ หากท่อรั่ว ให้เทชั้นบนแล้วไหลผ่านท่อใหม่และเริ่มกรองด้วยอัลตราฟิลเตรชั่น เพื่อตัดสินได้อย่างแม่นยำว่าท่อรั่วหรือไม่ ให้ปั่นแยกด้วย BSA 5mgml เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงไหลผ่าน รันกาวโปรตีนหรือ Bradford สำหรับการวัดคร่าวๆ แล้วเติมสารละลายโปรตีนที่เหลือเพื่อความเข้มข้นต่อไป (ทำงานบนน้ำแข็งเพื่อป้องกันไม่ให้โปรตีนถูกกักขัง อุ่น) จนกระทั่งสารละลายเข้มข้นทั้งหมดถูกเติม ให้ความสนใจว่าการตกตะกอนของโปรตีนเกิดขึ้นระหว่างการหมุนเหวี่ยงหรือไม่ ซึ่งส่งผลให้ท่ออุดตัน หากเกิดการตกตะกอน ให้ระบุสาเหตุเฉพาะของการตกตะกอน ไม่ว่าความเข้มข้นของโปรตีนสูงเกินไปหรือบัฟเฟอร์ไม่เหมาะสม อดีตสามารถแก้ไขได้โดยอัลตราฟิลเตรชันพร้อม ๆ กันกับหลอดอัลตราฟิลเตรชั่นหลายหลอดเพื่อลดความเข้มข้น อย่างหลังคือการเปลี่ยนสารละลายบัฟเฟอร์ต่างๆ จนกว่าโปรตีนจะไม่ตกตะกอน

(5) ขั้นตอนก่อนหน้านี้ใช้เพื่อสร้างความเข้มข้นของโปรตีน หากคุณต้องการเปลี่ยนบัฟเฟอร์ เมื่อสารละลายโปรตีนทั้งหมดเข้มข้นถึง 1 มล. ให้ค่อยๆ เพิ่มบัฟเฟอร์ใหม่ (การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันผ่าน 0.22um เมมเบรนอัลตราฟิลเตรชัน) จากนั้นให้เข้มข้นถึงประมาณ 1 มล. เป็นเวลาสามครั้งติดต่อกัน ปริมาตรสุดท้ายของความเข้มข้นสุดท้ายขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของโปรตีนที่ต้องการ ซึ่งโดยทั่วไปจะไม่เกิน 500ul หรือสามารถทำให้เข้มข้นให้น้อยกว่า 200ul ตามความเข้มข้นของปริมาตรอย่างน้อย 10 ครั้งในแต่ละครั้ง สามารถเข้าถึงมากกว่า 1,000 ครั้งสามครั้ง ซึ่งโดยทั่วไปสามารถบรรลุวัตถุประสงค์ของการเปลี่ยนบัฟเฟอร์