ปัญหาความคงตัวและแนวทางแก้ไขของยาชีวภาพในกระบวนการผลิต

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ยารักษาโรคจากเทคโนโลยีชีวภาพ โดยเฉพาะยาโมโนโคลนอล ค่อยๆ กลายเป็นส่วนสำคัญของการวิจัยและพัฒนายาใหม่ อย่างไรก็ตาม โดยทั่วไปชีววิทยาของโปรตีนจะมีปัญหาเกี่ยวกับโครงสร้างที่ซับซ้อนและไม่เสถียร โดยเฉพาะปัจจัยต่างๆ ที่ไม่เสถียรในกระบวนการผลิต ซึ่งส่งผลให้เกิดการย่อยสลายและการใช้งานของชีววิทยา กระบวนการเตรียมยาชีวภาพมีความซับซ้อนมาก โดยมักผ่านการสังเคราะห์ทางชีวภาพ (เช่น การหมักจุลินทรีย์/การเพาะเลี้ยงเซลล์) การทำให้สต็อกบริสุทธิ์และการกลั่น (เช่น การทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโตกราฟี การกำจัดไวรัส) และกระบวนการเตรียมการ (เช่น รูปแบบการเตรียมการ การกรองแบบปลอดเชื้อ การบรรจุ การแช่แข็ง - การตรวจสอบการทำให้แห้งและหลอดไฟ) และการผลิต การจัดเก็บ การขนส่ง และการเชื่อมโยงอื่นๆ ดังนั้นการแก้ปัญหาความไม่แน่นอนเหล่านี้จึงเป็นกุญแจสำคัญในการนำยาชีวภาพไปใช้ในทางคลินิกได้สำเร็จ ในบทความนี้ เราได้สรุปวิธีการย่อยสลายในการผลิตยาชีวภาพและนำเสนอวิธีแก้ปัญหาที่เกี่ยวข้อง

 

เนื่องจากเทคโนโลยีชีวภาพ (เช่นเทคโนโลยี DNA recombinant, เทคโนโลยี lymphocyte hybridoma, เทคโนโลยี phage display) และการพัฒนาของจีโนมมนุษย์, ยาเทคโนโลยีชีวภาพ (ยาชีวภาพ, ยาชีวภาพ, ยาชีวภาพ, ยาชีวภาพ, ยาชีวภาพ) โดยเฉพาะยาโมโนโคลนอล ค่อยๆ กลายเป็นเนื้อหาหลัก ของการวิจัยและพัฒนายาใหม่ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ยาชีวภาพคิดเป็น 80% ของยาตามใบสั่งแพทย์ที่ขายดีที่สุด 10 อันดับแรกของโลก และสัดส่วนของสาขาเภสัชกรรมทั้งหมดก็เพิ่มขึ้นทุกปีเช่นกัน เมื่อเทียบกับยาโมเลกุลเล็กแบบดั้งเดิมที่มีการสังเคราะห์ทางเคมี ยาชีวภาพส่วนใหญ่เตรียมและผลิตโดยวิธีการเทคโนโลยีชีวภาพ โดยเฉพาะเทคโนโลยี DNA ลูกผสมซึ่งมีลักษณะของการออกฤทธิ์สูง ความจำเพาะสูง และความเป็นพิษต่ำ และแก้ปัญหาทางการแพทย์มากมายที่โมเลกุลเล็กแบบดั้งเดิม ยาไม่สามารถแก้ปัญหาได้ จึงมีบทบาทสำคัญมากขึ้นในการช่วยชีวิตและปรับปรุงคุณภาพชีวิตของผู้ป่วย

อย่างไรก็ตาม การพัฒนายาชีวภาพยังเผชิญกับความท้าทายทางเทคนิคหลายประการ ประการแรก ชีวเภสัชภัณฑ์คือชีวโมเลกุล (มวลโมเลกุลสัมพัทธ์โดยปกติคือ 5x103~2×105) ซึ่งมีโครงสร้างและส่วนประกอบที่ซับซ้อนมาก นอกเหนือจากโครงสร้างหลัก ซึ่งก็คือลำดับกรดอะมิโน ยาชีวภาพมักจะมีโครงสร้างระดับสูงที่ซับซ้อน (เช่น โครงสร้างทุติยภูมิ ตติยภูมิ หรือแม้แต่ควอเทอร์นารี) ซึ่งเป็นพื้นฐานของกิจกรรมทางชีวภาพ

 

ในเวลาเดียวกัน เนื่องจากปัจจัยต่างๆ เช่น การดัดแปลงหลังการแปล การไฮโดรไลซิสของเอนไซม์ และการย่อยสลายทางเคมี ยาชีวภาพทั่วไปจึงเป็นส่วนผสมที่ซับซ้อนอย่างยิ่งซึ่งประกอบด้วยโมเลกุลนับล้านหรือมากกว่านั้น ประการที่สอง ยาชีวภาพไม่เสถียรและมีแนวโน้มที่จะสลายตัวทางเคมีและกายภาพ การย่อยสลายทางเคมีเกี่ยวข้องกับการแตกและการก่อตัวของพันธะโควาเลนต์ ในขณะที่การย่อยสลายทางกายภาพมีลักษณะเฉพาะในยาชีวภาพ และไม่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงพันธะโควาเลนต์ แต่โดยหลักแล้วการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างระดับสูงของโปรตีน รวมถึงการดูดซับทางกายภาพ (ไปยังพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำ) การเปลี่ยนสภาพ การแยกโพลีเมอร์ การรวมตัว และการตกตะกอน การย่อยสลายเหล่านี้จะไม่เพียงส่งผลต่อกิจกรรมทางชีวภาพเท่านั้น แต่ยังอาจทำให้เกิดปัญหาด้านความปลอดภัยอีกมากมายอีกด้วย ประการที่สอง ไม่เหมือนกับยาที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก ยาชีวภาพเกือบทั้งหมดมีศักยภาพในการสร้างภูมิคุ้มกัน กล่าวคือ ความสามารถในการกระตุ้นร่างกายให้สร้างแอนติบอดีจำเพาะหรือกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาว

 

นอกเหนือจากโครงสร้างของยาชีวภาพแล้ว ภูมิคุ้มกันยังเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความคงตัวของยาทางชีววิทยา โดยเฉพาะโพลีเมอร์และอนุภาคโปรตีน ซึ่งง่ายต่อการกระตุ้นให้ร่างกายสร้างแอนติบอดีที่สอดคล้องกันเพื่อล้างยา ส่งผลต่อประสิทธิภาพของยา และ แม้เนื่องจากปฏิกิริยาข้ามสามารถต่อต้านโปรตีนภายนอกในร่างกายมนุษย์ได้ ตัวอย่างเช่น แอนติบอดีที่ผลิตเมื่อใช้การรักษาด้วยอีริโธรโพอิตินของมนุษย์ (EprexR) ไม่เพียงแต่ทำให้ยาที่เป็นโปรตีนเป็นกลางเท่านั้น แต่ยังจับโปรตีนจากภายนอกของมนุษย์เพื่อยับยั้งการทำงานของพวกมัน ส่งผลให้เกิดความผิดปกติของการสร้างเซลล์เม็ดเลือดแดงบริสุทธิ์ในผู้ป่วย การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันอาจทำให้เกิดปฏิกิริยาภูมิไวเกิน ซึ่งอาจเป็นอันตรายต่อชีวิตของผู้ป่วยในกรณีร้ายแรง

การเปลี่ยนแปลงเล็กๆ น้อยๆ บางอย่าง (เช่น โครงสร้าง) ที่เกิดขึ้นระหว่างการผลิตยาชีวภาพอาจสังเกตได้ยากในระหว่างกระบวนการผลิตหรือการเก็บรักษาระยะสั้นผ่านเทคโนโลยีการวิเคราะห์ที่มีอยู่ แต่อาจส่งผลต่อความเสถียรของกระบวนการจัดเก็บในระยะยาว จึงทำให้มี ผลกระทบที่มากขึ้นต่อคุณภาพขั้นสุดท้ายของผลิตภัณฑ์ คุณภาพของโรงงานผลิต วัตถุดิบและวัสดุบรรจุภัณฑ์ ตลอดจนการฝึกอบรมและการปฏิบัติงานของพนักงานจะมีผลกระทบอย่างมากต่อคุณภาพของผลิตภัณฑ์เช่นกัน ในบทความนี้ เราจะสรุปปัญหาทั่วไปที่ส่งผลต่อความเสถียรของยาชีวภาพในกระบวนการผลิต และนำเสนอวิธีแก้ปัญหาที่เกี่ยวข้อง

 

01 กระบวนการเตรียมยาชีวภาพ

ขั้นตอนการเตรียมยาชีวภาพมีความซับซ้อนมาก ตั้งแต่การสังเคราะห์ทางชีวภาพไปจนถึงการบรรจุขั้นสุดท้ายไปจนถึงการเตรียมการทางคลินิก โดยปกติจำเป็นต้องผ่านขั้นตอนการผลิต การจัดเก็บ และการขนส่งต่างๆ รวมถึงการสังเคราะห์ทางชีวภาพ (เช่น การหมักจุลินทรีย์/การเพาะเลี้ยงเซลล์) การทำน้ำสต็อกให้บริสุทธิ์ การกลั่น (เช่น การทำโครมาโทกราฟีให้บริสุทธิ์ การกำจัดไวรัส) และการเตรียมการ กระบวนการ (เช่น รูปแบบการเตรียมการ การกรองแบบปลอดเชื้อ การบรรจุ การทำแห้งแบบเยือกแข็ง และการตรวจสอบหลอดไฟ) ยกตัวอย่างยาชีวภาพแอนติบอดีที่ได้รับความนิยมมากที่สุด ขั้นตอนการผลิตโดยทั่วไปประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ขั้นแรก เซลล์ไลน์จะละลายและค่อยๆ ขยายตัวในสภาพแวดล้อมที่มีการเติบโตที่เหมาะสมเพื่อตอบสนองความต้องการในการผลิตในที่สุด

 

In the cell culture process, the environment of biologic medicines including cells, various proteolytic enzymes, nutrients and dissolved oxygen, etc., usually need to be maintained at a relatively high temperature (>30 องศา ) และสภาวะ pH ที่เป็นกลางเป็นเวลามากกว่าหรือเท่ากับ 10 วันจนกว่าจะมีการสังเคราะห์โปรตีนและการหลั่งออกนอกเซลล์อย่างเพียงพอ หลังจากการสังเคราะห์ยาทางชีววิทยา สารตกค้างในเซลล์ที่ไม่ละลายน้ำจะถูกกำจัดออกโดยการหมุนเหวี่ยงหรือการกรอง จากนั้นส่วนเหนือตะกอนที่มียาทางชีววิทยาจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยคอลัมน์โครมาโตกราฟีหลายๆ คอลัมน์ เช่น โครมาโทกราฟีแบบอัฟฟินิตี้โปรตีน A (โครมาโทกราฟีโปรตีน A) โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนบวก และการแลกเปลี่ยนไอออนลบ โครมาโตกราฟี และไวรัสจะถูกกำจัดและหยุดการทำงาน

หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ สารชีวภาพจะถูกแทนที่ด้วยบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมโดยการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันหรือการซึมผ่าน และเก็บไว้ในสารตัวยา หรือในรูปแบบของปริมาณสุดท้ายเมื่อเติมลงในส่วนประกอบการเตรียมการขั้นสุดท้าย ผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปได้มาจากการบรรจุลงในวัสดุบรรจุภัณฑ์ภายในต่างๆ (ภาชนะปิดแน่นอน) หรือเตรียมเพิ่มเติมเป็นผงแห้งแช่แข็งโดยการบำบัดแห้งแช่แข็ง ตลอดกระบวนการผลิต โปรตีนต้องผ่านปัจจัยการทำลายล้างหลายอย่าง เช่น pH ต่ำ เกลือสูง การละลายเยือกแข็ง แสง การสั่น การตัด และพื้นผิวต่างๆ (ไม่ชอบน้ำ) ซึ่งอาจก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างหรือการย่อยสลายของโปรตีน ด้วยเหตุนี้ ส่งผลกระทบต่อคุณภาพของยาชีวภาพ และแต่ละขั้นตอนสามารถปรับให้เหมาะสมเพื่อหลีกเลี่ยงหรือลดการย่อยสลายที่เกิดขึ้นได้

 

02 การย่อยสลายและการควบคุมยาชีวภาพในระหว่างการหมักจุลินทรีย์/การเพาะเลี้ยงเซลล์

การหมักจุลินทรีย์/กระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์อาจส่งผลต่อความคงตัวของยาที่เป็นโปรตีนที่แสดงออกมา แต่มีรายงานเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับความคงตัวของยาทางชีววิทยาในกระบวนการหมักจุลินทรีย์/กระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ หรือปัญหานี้ยังไม่ได้รับความสนใจเพียงพอ สาเหตุหลักของปรากฏการณ์นี้อาจเป็นเพราะในกระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ L ของการหมักจุลินทรีย์นั้น จะมีการให้ความสนใจมากขึ้นกับสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์/เซลล์และปริมาณการแสดงออก และผลิตภัณฑ์ที่ย่อยสลายบางส่วนสามารถกำจัดออกได้โดยการทำให้บริสุทธิ์ในภายหลัง หรือ การสูญเสียโปรตีนที่เกิดจากการย่อยสลายจะถือว่ามีสาเหตุจากการแสดงออกของโปรตีนที่ไม่เพียงพอ

 

ตามหลักการ QbD ของการพัฒนายาชีวภาพและแนวทางที่เกี่ยวข้อง เช่น FDA สิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องกับผลิตภัณฑ์จะถูกระงับได้ดีที่สุดในระดับแนวหน้าของการผลิต ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์และกระบวนการอื่น ๆ เพื่อกำจัด หากไม่มีวิธีการกำจัดที่มีประสิทธิภาพจำเป็นต้องแสดงให้เห็นว่าสิ่งเจือปนไม่ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อความปลอดภัยและประสิทธิภาพของยา แต่จะต้องใช้การวิจัยเพิ่มเติมจำนวนมากและมีความเสี่ยงที่จะเกิดความไม่แน่นอนบางประการเนื่องจากคุณภาพไม่ดี การศึกษาเป้าหมาย ดังนั้นกลยุทธ์ที่ต้องการคือการพิจารณายับยั้งการย่อยสลายเหล่านี้ที่แหล่งกำเนิด

มีหลายปัจจัยที่ทำให้เกิดการย่อยสลายโปรตีนในระหว่างการหมักจุลินทรีย์/การเพาะเลี้ยงเซลล์ ประการแรกคือปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อม เช่น อุณหภูมิสูง ค่า pH เป็นกลาง ออกซิเจนที่ละลายน้ำ ความแรงของเกลือไอออน เป็นต้น อุณหภูมิของการเพาะเลี้ยงเซลล์จะสูงกว่าการเก็บรักษาตามปกติมาก อุณหภูมิ (เช่น 2 ถึง 8 องศา ) และเช่นเดียวกับปฏิกิริยาทางเคมีส่วนใหญ่ อุณหภูมิยิ่งสูงเท่าไร การย่อยสลายโปรตีนก็จะเร็วขึ้นเท่านั้น ที่ pH เป็นกลาง โปรตีนหลายชนิด รวมถึงโมโนโคลนอลแอนติบอดี มีแนวโน้มที่จะรวมตัวและดีอะมิเดชันมากกว่า ความเข้มข้นของออกซิเจนละลายน้ำที่ลดลงอาจส่งผลให้เกิดการจับคู่พันธะโปรตีนไดซัลไฟด์ที่ไม่สมบูรณ์

 

นอกจากนี้ ส่วนประกอบของตัวกลาง เช่น ไอออนของโลหะ (เช่น ไอออนของทองแดง) กรดอะมิโน (เช่น ซีสเตอีน) ฯลฯ ก็จะส่งผลต่อคุณภาพของยาชีวภาพเช่นกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งการก่อตัวและการแลกเปลี่ยนพันธะไดซัลไฟด์ สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ได้รับการปรับปรุงสามารถปรับปรุงความคงตัวของโปรตีนได้ แต่กระบวนการใดๆ จะต้องมีทั้งประสิทธิผลและดำเนินการได้ เนื่องจากสภาวะการแสดงออกของโปรตีนหลายชนิดอาจขัดแย้งกับความคงตัวของโปรตีน การเปลี่ยนแปลงในสภาวะการหมักจุลินทรีย์/สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยเฉพาะอาจส่งผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมาย การเติบโตของเซลล์ สิ่งเจือปนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการ และระดับไกลโคซิเลชัน ในเวลานี้ จำเป็นต้องดำเนินการพิจารณาและเพิ่มประสิทธิภาพอย่างครอบคลุม

 

03 การย่อยสลายและการควบคุมสารชีวเคมีในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์และการกำจัดแบคทีเรีย/การกำจัดไวรัส

3.1 การทำให้บริสุทธิ์

The purification process is usually used to remove impurities and improve the purity of the medicine, but the conditions of some purification processes are relatively intense and the protein may be degraded. For example, protein A affinity chromatography used to purify monoclonal antibodies usually requires elution under acidic conditions (such as pH 3 to 4), however, some monoclonal antibodies are sensitive to acid, resulting in reduced or lost biologic activity. For example, the anti-CD52 monoclonal antibody alemtu-zumab (Campath) aggregated in >25% หลังจากการทำให้บริสุทธิ์โดยโปรตีน A โครมาโทกราฟี สำหรับโปรตีนที่ไวต่อกรดเหล่านี้ เวลาในการชะต้องลดลง และการชะควรทำให้เป็นกลางตามเวลาหลังจากการชะ หรือชะที่อุณหภูมิต่ำกว่า นอกจากนี้ การใช้ระบบบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมที่สุด (เช่น การเติมอาร์จินีน) สามารถยับยั้งการสร้างการรวมกลุ่มได้อย่างมีนัยสำคัญและปรับปรุงการฟื้นตัวของแอนติบอดีให้ดีขึ้น

 

ในโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน มักจำเป็นต้องใช้เกลือที่มีความเข้มข้นสูงขึ้น (เช่น โซเดียมคลอไรด์และโซเดียมอะซิเตต) และเพื่อปรับ pH ของสารละลายให้เหมาะสมกับโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุลบหรือไอออนบวก ขณะเดียวกันก็ทำให้มั่นใจว่าสภาวะเหล่านี้ ไม่ส่งผลต่อคุณภาพของโปรตีน โมโนโคลนอลแอนติบอดีบางชนิดไวต่อเกลือในปริมาณมากมากกว่าและมีแนวโน้มที่จะก่อตัวเป็นโปรตีนรวมตัว เช่น สีเหลือบและอนุภาค เราพบว่าการชะล้างด้วยฮิสทิดีนเป็นบัฟเฟอร์แทนการใช้เกลือในปริมาณมากสามารถยับยั้งปฏิกิริยาการรวมตัวดังกล่าวได้อย่างมีประสิทธิภาพ (ข้อมูลไม่ได้รับการเผยแพร่)

ในโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนที่ไม่ชอบน้ำ โปรตีนจะถูกแยกออกจากกันโดยความสัมพันธ์ระหว่างหมู่ที่ไม่ชอบน้ำและเฟสเคลื่อนที่ และถูกดูดซับอย่างง่ายดายบนพื้นผิวที่ไม่ชอบน้ำเพื่อทำให้เสียสภาพ อย่างไรก็ตาม มีความอ่อนโยนกว่าโครมาโตกราฟีแบบรีเวิร์สเฟสมาก ซึ่งจำเป็นต้องชะล้างโปรตีนโดยใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ วิธีการเติมอาร์จินีนลงในสารละลายตัวอย่างหรือเฟสเคลื่อนที่ยังสามารถใช้เพื่อปรับปรุงการนำโปรตีนกลับมาใช้ใหม่ได้

 

3.2 การฆ่าเชื้อ/การกำจัดไวรัส

เนื่องจากยาชีวภาพจำเป็นต้องบริหารโดยวิธีฉีด การทำหมันและการกำจัดไวรัสจึงเป็นกระบวนการที่จำเป็นสำหรับชีวเภสัชภัณฑ์ ซึ่งรวมถึงการกำจัดทางกายภาพและการเลิกใช้งานสารเคมีเป็นหลัก การกำจัดทางกายภาพคือการแยกแบคทีเรียหรือไวรัสออกจากยาชีวภาพด้วยวิธีการทางกายภาพ วิธีการหลักคือการกรองด้วยเมมเบรน/นาโนฟิลเตรชัน และโครมาโทกราฟี การยับยั้งทางเคมีคือการยับยั้งแบคทีเรียหรือไวรัสโดยวิธีทางเคมี ซึ่งส่วนใหญ่รวมถึงการใช้สารลดแรงตึงผิว การให้ความร้อน การบำบัดด้วยกรด และการบำบัดด้วยรังสี UV/Y

Sterilization by heat treatment means that the solution is heated to 60 ℃ for 10 h. When sterilizing by heat treatment, it is necessary to pay attention to whether the target protein can withstand the conditions. If the melting temperature (Tm) of human blood albumin is close to 60 ℃, it is generally necessary to add some protective agents, such as sodium caprylate and acetyltryptophan, to raise the Tm to >70 องศาก่อนการฆ่าเชื้อด้วยความร้อน ในเวลาเดียวกัน ควรให้ความสนใจกับผลกระทบของโปรตีนเบ็ดเตล็ดบางชนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่งการติดตามปริมาณของโปรตีนเบ็ดเตล็ดที่มีอุณหภูมิหลอมเหลวต่ำ และอนุภาคที่เกิดขึ้นหลังจากการย่อยสลายของสิ่งเจือปนเหล่านี้จะกลายเป็นไซต์ที่เกิดนิวเคลียสสำหรับการรวมตัวของโปรตีน ซึ่งเร่งการรวมตัวของ โปรตีนเป้าหมาย หากสารละลายมีซูโครส ควรพิจารณาด้วยว่าซูโครสมีแนวโน้มที่จะไฮโดรไลซิสเพื่อสร้างกลูโคสและฟรุกโตสภายใต้สภาวะที่มีอุณหภูมิสูง และน้ำตาลรีดิวซ์ทั้งสองนี้จะมีปฏิกิริยา Maillard กับกลุ่มโปรตีนอะมิโนอิสระ ส่งผลให้การย่อยสลายของ ยาชีวภาพ

ในการฆ่าเชื้อด้วยการฉายรังสี จำเป็นต้องใส่ใจกับการย่อยสลายทางเคมีและทางกายภาพของโปรตีนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และโดยปกติจำเป็นต้องเพิ่มสารกำจัดอนุมูลอิสระเพื่อปกป้องโปรตีน

 

3.3 การแช่แข็ง-ละลาย

การแช่แข็งและละลายเป็นกระบวนการที่จำเป็นในการผลิตยาชีวภาพ เช่น กระบวนการรอในขั้นตอนต่างๆ ของกระบวนการผลิต หรือการเปลี่ยนสถานที่/การขนย้าย และยังเป็นวิธีทั่วไปในการเก็บรักษาสารละลายสต็อกในระยะยาว . นอกจากนี้ การละลายน้ำแข็งโดยไม่ได้ตั้งใจอาจเกิดขึ้นเมื่อขนส่งผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปหรือผู้ป่วยใช้ที่บ้าน โปรตีนบางชนิดไวต่อการแช่แข็งและละลายได้มาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่ไม่มีสารป้องกันที่เหมาะสม ซึ่งอาจทำให้โปรตีนหมดฤทธิ์ได้ง่าย ดังนั้นการทดลองแช่แข็งและละลายจึงเป็นส่วนสำคัญของการตรวจคัดกรองใบสั่งยาตามสูตรผสมด้วย

กลไกของการทำลายโปรตีนด้วยการแช่แข็งและละลายมีดังนี้ ประการแรก พื้นผิวของน้ำแข็งที่เกิดขึ้นระหว่างการแช่แข็งเป็นสาเหตุสำคัญของการสูญเสียโปรตีน และโปรตีนมีแนวโน้มที่จะถูกดูดซับไปที่พื้นผิวเหล่านี้เพื่อการสูญเสียสภาพและการรวมตัว ประการที่สอง หลังจากที่น้ำจำนวนมากกลายเป็นน้ำแข็งในระหว่างกระบวนการแช่แข็ง ความเข้มข้นของตัวถูกละลายที่เหลือและโปรตีนเองจะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว และยิ่งความเข้มข้นของโปรตีนสูงขึ้นเท่าใด โอกาสของการชนกันระหว่างโมเลกุลก็จะยิ่งเกิดขึ้น และการก่อตัวที่รุนแรงมากขึ้นเท่านั้น ของการรวมตัว

 

ตามกลไกปฏิกิริยาของการย่อยสลายโปรตีน มีหลายวิธีในการยับยั้งการย่อยสลายโปรตีนที่เกิดจากการแช่แข็งและละลาย ตัวอย่างเช่นที่แปดในตัวแทนน้ำน้ำแข็ง (เช่น polysorbate 20, polysorbate 80) เพื่อยับยั้งการย่อยสลายที่เกิดจากพื้นผิวของน้ำแข็ง ความคงตัวทางอุณหพลศาสตร์ (การรักษาโปรตีนให้อยู่ในสถานะธรรมชาติ) เพิ่มขึ้นโดยการปรับ pH และความแรงของไอออนิกของสารละลาย และโดยการเติมส่วนเติมเนื้อยา/สารป้องกัน

สำหรับการจัดเก็บสต็อกยาชีวภาพในระยะยาว โดยปกติจำเป็นต้องเก็บโปรตีนให้ต่ำกว่าอุณหภูมิการเปลี่ยนสถานะคล้ายแก้ว (T') ของความเข้มข้นสูงสุดแช่แข็งเพื่อให้แน่ใจว่ามีการเคลื่อนที่ต่ำมาก (ความเสถียรทางจลน์) ตัวอย่างเช่น สารละลายโปรตีนที่มีซูโครสเป็นสารป้องกัน เนื่องจาก T' ของมันอยู่ที่ประมาณ -30 องศา จึงจำเป็นต้องเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -40 องศาหรือต่ำกว่านั้นด้วยซ้ำ

 

อัตราการแช่แข็งและละลายยังส่งผลต่อความคงตัวของยาชีวภาพด้วย หากการแช่แข็งช้าเกินไป โปรตีนจะถูกย่อยสลายได้ง่ายขึ้นในสภาวะที่มีความเข้มข้นสูงขึ้นเป็นเวลานาน ในทางตรงกันข้าม ภายใต้สภาวะที่รวดเร็วมาก (เช่น -80 องศา ) อาจเกิดพื้นผิวน้ำแข็งจำนวนมาก ซึ่งทำให้เกิดการเสื่อมสภาพเนื่องจากพื้นผิวด้วย อัตราการหลอมก็มีความสำคัญเช่นกัน โดยละลายช้า (เช่น 4 องศา) ทำให้เกิดความเสียหายเพิ่มเติมโดยการตกผลึกของน้ำที่ละลายบนพื้นผิวของน้ำที่เป็นน้ำแข็ง ดังนั้นในกระบวนการผลิตโดยทั่วไปแนะนำให้ละลายผลิตภัณฑ์แช่แข็งด้วยความเร็วที่เร็วขึ้นเท่าที่จะทำได้ เช่น การใช้น้ำไหลเพื่อเร่งการละลาย

นอกจากนี้ ในระหว่างกระบวนการแช่แข็ง ตัวถูกละลายบางชนิดจะตกผลึกเนื่องจากการก่อตัวของน้ำแข็งและความสามารถในการละลายลดลง โดยทั่วไปที่สุดคือบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟตเมื่อเทียบกับโซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตความสามารถในการละลายของโซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟตมีความไวต่ออุณหภูมิมากที่สภาวะอุณหภูมิต่ำจะเป็นการตกตะกอนครั้งแรกส่งผลให้ค่า pH ของสารละลายลดลงถึง 3 ถึง 4 หน่วย ในเวลานี้โปรตีนที่ไวต่อกรดมีแนวโน้มที่จะย่อยสลาย โปรตีนบางชนิดที่มีโครงสร้างหน่วยย่อยหลายโครงสร้าง เช่น อะโพนีโอคาร์ซิโนสแตตินและสตาฟิโลคอคคัสนิวคลีเอส มีการสูญเสียสภาพที่อุณหภูมิต่ำเนื่องจากการกระทำที่ไม่ชอบน้ำลดลงของการเชื่อมโยงหน่วยย่อยด้วยอุณหภูมิที่ลดลง

 

3.4 การกรอง/การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน

การกรองแบบเมมเบรนสำหรับสารละลายโปรตีนมีสามประเภทหลัก ได้แก่ การกรองแบบปลอดเชื้อ การกรองแบบนาโน และการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน/การซึมผ่าน การกรองฆ่าเชื้อแบคทีเรียส่วนใหญ่จะใช้เพื่อกำจัดอนุภาคและแบคทีเรียที่ไม่ละลายน้ำ ซึ่งมักใช้ก่อนการบรรจุผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย นาโนฟิลเตรชันส่วนใหญ่จะใช้เพื่อกำจัดไวรัส อัลตราฟิลเตรชัน/การซึมผ่านส่วนใหญ่จะใช้เพื่อแทนที่ตัวอย่างที่บริสุทธิ์ลงในบัฟเฟอร์ของการเตรียมขั้นสุดท้ายและทำให้เข้มข้น ในขณะเดียวกันก็หลีกเลี่ยงการเติมอัลคาไลเข้มข้นหรือกรดแก่โดยตรงลงในสารละลายโปรตีนเพื่อปรับ pH ของสารละลาย และการเติมสารอื่นๆ ส่วนเติมเนื้อยาที่เป็นของแข็งอาจทำให้เกิดความร้อนเฉพาะที่และส่งผลต่อความคงตัวของโปรตีน

อย่างไรก็ตาม การกรองด้วยเมมเบรนจะมีผลกระทบบางอย่างต่อโปรตีน และปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนและเยื่อกรองอาจลดความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลายสต๊อก และทำให้โปรตีนเสื่อมคุณภาพ ซึ่งมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญมากกว่าต่อยาที่มีความเข้มข้นของโปรตีนต่ำ โดยทั่วไป ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับเมมเบรนกรอง และระหว่างโปรตีนกับโปรตีนสามารถลดลงได้โดยการเติมสารลดแรงตึงผิว นอกจากนี้ ตัวกรองคุณภาพต่ำบางตัวจะกำจัดอนุภาคบางส่วนและกลายเป็นจุดเกิดนิวเคลียสสำหรับการรวมตัวของโปรตีน ซึ่งจะช่วยเร่งการรวมตัวของโปรตีน การเลือกเมมเบรนกรองคุณภาพสูงเป็นสิ่งสำคัญ

 

นอกจากนี้ จะต้องพิจารณาผลกระทบของ Donnan ในกระบวนการอัลตราฟิลเตรชันด้วย ผลกระทบของ Donnan หมายความว่าในระหว่างกระบวนการกรองเมมเบรน โพลีเมอร์ (เช่น โปรตีนโมเลกุลขนาดใหญ่) จะติดอยู่ในเมมเบรน และอิเล็กโทรไลต์ที่มีประจุตรงกันข้ามในสารละลายจะรวมตัวกันมากขึ้นรอบๆ โพลีเมอร์เนื่องจากการดึงดูดประจุร่วมกัน ดังนั้น เมมเบรนกรองไม่สามารถซึมผ่านได้อย่างสมบูรณ์ในระหว่างกระบวนการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน ส่งผลให้มีความเข้มข้นเพิ่มขึ้น แอนติบอดีทั่วไปจะมีประจุบวกในอัลตราฟิลเตรต ดังนั้นอิเล็กโทรไลต์ประจุลบจะถูกเสริมด้วยแอนติบอดีและความเข้มข้นจะเพิ่มขึ้น

โดยทั่วไป ยิ่งความเข้มข้นของบัฟเฟอร์เริ่มต้นต่ำและความเข้มข้นของโปรตีนสูงขึ้นหลังจากการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน ยิ่งผลของ Daunan ชัดเจนยิ่งขึ้นและผลกระทบต่อ pH ของบัฟเฟอร์มีนัยสำคัญมากขึ้นเท่านั้น หากบัฟเฟอร์ที่มีฮิสทิดีน ค่า pH จะเพิ่มขึ้นเมื่อการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันทำให้ยาแอนติบอดีเข้มข้น และแม้แต่ค่า pH ของสารเตรียมก็จะเกินมาตรฐานการควบคุมคุณภาพ และทำให้ผลิตภัณฑ์ไม่ผ่านการรับรอง

 

04 การย่อยสลายและการควบคุมยาชีวภาพในกระบวนการเตรียมผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป

4.1 การกำหนดค่าและการผสม

ในกระบวนการผลิต เนื่องจากยาชีวภาพที่เกี่ยวข้องมีขนาดใหญ่ การกำหนดค่าการเตรียมและการดำเนินการผสมจึงมีความสำคัญมาก เช่น โปรตีนในท้องถิ่นหรือความเข้มข้นของสารเพิ่มปริมาณสูงเกินไป หรือการเปลี่ยนแปลงของค่า pH ของสารละลายและความแข็งแรงของไอออนิกอาจทำให้เกิดการสูญเสียโปรตีน หรือการตกตะกอน ชนิด ขนาด ความเร็วในการผสม และเวลาของเครื่องกวนเชิงกลในระหว่างการผลิตอาจส่งผลต่อความเสถียรของยาทางชีววิทยา เช่น อัตราการผสมสูงเกินไป ส่งผลให้มีการเร่งการรวมตัวของโปรตีน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องปรับพารามิเตอร์เหล่านี้ให้เหมาะสมที่สุดเท่าที่จะทำได้ภายใต้สมมติฐานเพื่อให้ได้การผสมที่สม่ำเสมอ

 

4.2 การกรอก

ยาชีวภาพมีแนวโน้มที่จะสูญเสียสภาพและการรวมตัวในระหว่างกระบวนการบรรจุ สาเหตุหลักมาจากแรงทางกล เช่น แรงเฉือนที่เกิดจากกระบวนการสูบน้ำ และการย่อยสลายที่เกิดจากการตกตะกอนบางส่วน มีรายงานว่าสแตนเลสของปั๊มลูกสูบจะตกตะกอนอนุภาคนาโนบางส่วนและกลายเป็นจุดนิวเคลียสสำหรับการรวมตัวของแอนติบอดี ฟองอากาศขนาดเล็กที่เกิดขึ้นระหว่างกระบวนการเติมสามารถทำลายโปรตีนบนพื้นผิวของก๊าซ-ของเหลวได้ และฟองอากาศขนาดเล็กจะทำให้เกิดอนุมูลอิสระและ/หรือการเปลี่ยนแปลงความร้อนเฉพาะที่เมื่อแตก ซึ่งอาจทำให้โปรตีนเสียสภาพได้

 

4.3 การทำแห้งแบบเยือกแข็ง

ยาชีวภาพมีแนวโน้มที่จะใช้สูตรของเหลว เนื่องจากสูตรของเหลวมีข้อได้เปรียบที่สำคัญมากกว่าสูตรไลโอฟิไลซ์ในแง่ของต้นทุน ความเรียบง่ายของกระบวนการ และความสะดวกของผู้ป่วย อย่างไรก็ตาม โปรตีนบางชนิดมีความไม่เสถียรอย่างมากในสารละลายที่เป็นน้ำ และหากไม่ได้รับความคงตัวที่เพียงพอหลังจากการเพิ่มประสิทธิภาพของการเตรียมการ ดังนั้นควรพิจารณาการใช้การเตรียมแบบไลโอฟิไลซ์ กระบวนการไลโอฟิไลเซชันจะก่อให้เกิดปัจจัยการทำลายล้างหลายอย่าง ประการแรกคือปัจจัยการทำลายล้างในกระบวนการแช่แข็ง ซึ่งมีรายละเอียดไว้ก่อนหน้านี้

นอกจากนี้ โปรตีนยังอาจเผชิญกับปัจจัยการย่อยสลายภายใต้สภาวะที่แห้ง ตัวอย่างเช่น ชั้นความชุ่มชื้นบนพื้นผิวของโปรตีนมีความสำคัญมากต่อความคงตัวของโปรตีน Hageman เสนอว่าพื้นผิวของโปรตีนประกอบด้วยน้ำประมาณ 7% ซึ่งมีความสำคัญมากในการรักษาโครงสร้างของโปรตีน และปริมาณน้ำหลังจากการทำแห้งแบบเยือกแข็งโดยทั่วไปจะอยู่ระหว่าง 1% ถึง 2% ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้สารอื่นๆ เพื่อทดแทนบทบาทของน้ำ ระหว่างที่ขาดน้ำ ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญมากที่จะต้องเลือกใบสั่งยาและกระบวนการไลโอฟิไลเซชันที่ถูกต้อง เป็นที่เชื่อกันโดยทั่วไปว่าไดแซ็กคาไรด์ เช่น ซูโครสและทรีฮาโลสสามารถมีบทบาทค่อนข้างมีประสิทธิภาพในฐานะผู้ให้พันธะไฮโดรเจน ในขณะที่สารประกอบโพลีเมอร์ไม่สามารถมีบทบาทในการทดแทนน้ำได้อย่างมีประสิทธิภาพเนื่องจากผลของสเตอริก

 

นอกจากนี้ ภายใต้สมมติฐานของการควบคุมปริมาณน้ำแห้งเยือกแข็ง (เช่น 1% ถึง 2%) ซูโครสและทรีฮาโลสสามารถสร้างผงอสัณฐานที่มีค่า T สูง เพื่อให้สามารถรักษาทั้งระบบไว้ในสถานะของแข็งและ ยับยั้งการย่อยสลายทางกายภาพและเคมีระหว่างการเก็บรักษาระยะยาว อย่างไรก็ตาม สำหรับยาชีวภาพโพลีเปปไทด์ (เช่น กลูคากอน) เนื่องจากยาเหล่านี้ไม่มีโครงสร้างระดับสูงที่ค่อนข้างคงที่ น้ำตาลโพลีเมอร์ เช่น แป้งไฮดรอกซีเอทิลที่ไม่สามารถมีบทบาทเป็นพันธะไฮโดรเจนจึงสามารถให้ผลในการป้องกันในระดับสูง เช่น น้ำตาลสาหร่ายทะเล เมื่อเร็วๆ นี้ มีรายงานว่าการใช้กรดอะมิโนเป็นยาชีวภาพตัวใหม่ในการป้องกันการทำแห้งแบบเยือกแข็ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งอาร์จินีน สามารถใช้เพียงอย่างเดียวหรือผสมกับซูโครสได้อย่างมีประสิทธิภาพมาก เพื่อปกป้องความเสถียรของโปรตีนภายใต้สภาวะการแช่แข็งและการทำแห้งแบบเยือกแข็ง

 

05 การย่อยสลายและการควบคุมยาชีวภาพระหว่างการเก็บรักษา การขนส่ง และการใช้

ในกระบวนการจัดเก็บ การขนส่ง และการใช้งาน โปรตีนยังจะประสบกับสภาวะการย่อยสลายต่างๆ เช่น การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิในระยะสั้นระหว่างการเก็บรักษาและการขนส่ง การสั่นของการขนส่ง หรือความเสียหายเล็กน้อยระหว่างการขนส่งและการใช้งาน ซึ่งอาจมีผลกระทบต่อคุณภาพโปรตีนมากขึ้น . สำหรับชีวเภสัชภัณฑ์และวัคซีน การขนส่งด้วยโซ่เย็นถือเป็นปัจจัยสำคัญในการรับประกันคุณภาพของผลิตภัณฑ์ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีเหตุการณ์ด้านความปลอดภัยของวัคซีนเกิดขึ้นหลายครั้งในประเทศจีน เช่น กรณีวัคซีนซานซีในปี 2010 และกรณีวัคซีนผิดกฎหมายในซานตงในปี 2559 กรณีเหล่านี้ล้วนเกี่ยวข้องกับการจัดเก็บและขนส่งวัคซีนที่ไม่เหมาะสม และความเสี่ยงด้านความปลอดภัยของยาที่อาจเกิดขึ้นจาก สิ่งเหล่านี้ทำให้เกิดความกังวลอย่างมากต่อสังคมทั้งหมด ดังนั้นการเสริมสร้างการจัดการและการควบคุมในกระบวนการจัดเก็บ การขนส่ง และการใช้จึงเป็นส่วนเชื่อมโยงที่สำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าการใช้ยาชีวภาพอย่างปลอดภัย

 

06 บทสรุป

ยาชีวภาพเป็นโมเลกุลที่เปราะบางมากและคุณภาพของผลิตภัณฑ์มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกระบวนการผลิต ในกระบวนการผลิต การย่อยสลายทางเคมีและกายภาพต่างๆ เกิดขึ้นได้ง่าย โดยเฉพาะการย่อยสลายทางกายภาพของโมเลกุลขนาดใหญ่ของยาชีวภาพ ซึ่งสามารถเกิดขึ้นได้ภายใต้สภาวะทางกายภาพหรือทางกลต่างๆ ดังนั้น ประสบการณ์ของยาที่มีโมเลกุลขนาดเล็กจึงไม่สามารถนำไปใช้กับยาชีวภาพได้โดยตรง

ควรหลีกเลี่ยงสภาวะที่รุนแรงในกระบวนการผลิต เช่น การผสมสารละลายยาชีวภาพกับเครื่องผสมที่มีอัตราการกวนสูงเกินไป การใช้กรดหรือด่างแก่โดยตรงเพื่อปรับ pH ของสารละลาย หรือการเติมส่วนเติมเนื้อยาที่เป็นของแข็งลงในสารละลายโปรตีนโดยตรง ละลาย. แม้ว่าอาจไม่ก่อให้เกิดผลกระทบที่ตรวจพบได้ในระยะสั้น แต่ก็อาจส่งผลกระทบต่อโครงสร้างปกติของยาทางชีววิทยาในท้องถิ่น และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเหล่านี้จะถูกขยายออกไปในระหว่างการเก็บรักษาระยะยาว ซึ่งส่งผลต่อคุณภาพของผลิตภัณฑ์ในท้ายที่สุด

หากจำเป็น การประเมินเชิงเปรียบเทียบของกระบวนการผลิตหรือสารป้องกันที่แตกต่างกันสามารถเร่งได้โดยใช้การทดสอบความเสถียรของการย่อยสลายแบบเร่งและบังคับกับสต็อกหรือผลิตภัณฑ์สำเร็จรูป ควรให้ความสนใจเป็นพิเศษกับผลิตภัณฑ์ที่ย่อยสลายเหล่านี้ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์และการบรรจุ เนื่องจากจะยังคงอยู่ในผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปและนำไปใช้ในผู้ป่วยในที่สุด ซึ่งทำให้เกิดปัญหาด้านความปลอดภัย ประสิทธิภาพ และภูมิคุ้มกัน

ในแง่หนึ่ง กระบวนการผลิตชีวเภสัชภัณฑ์เป็นตัวกำหนดคุณภาพ ซึ่งต้องมีการวิเคราะห์กลไกการย่อยสลายของโมเลกุลเหล่านี้ และการยับยั้งการย่อยสลายที่เป็นไปได้ตลอดกระบวนการผลิต เพื่อให้แน่ใจว่าผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายสามารถนำไปใช้กับผู้ป่วยได้อย่างปลอดภัยและมีประสิทธิภาพ

 

เกี่ยวกับ กิดลิ่ง

Guidling Technology เป็นองค์กรเทคโนโลยีขั้นสูงระดับประเทศที่มุ่งเน้นด้านเภสัชภัณฑ์ชีวภาพ การเพาะเลี้ยงเซลล์ การทำให้บริสุทธิ์และความเข้มข้นของชีวเวชศาสตร์ การวินิจฉัยโรค และของเหลวทางอุตสาหกรรม เราประสบความสำเร็จในการพัฒนาอุปกรณ์กรองแบบแรงเหวี่ยง ตลับกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันและไมโครฟิลเตรชัน ตัวกรองไวรัส ระบบ TFF ตัวกรองเชิงลึก เส้นใยกลวง ฯลฯ ซึ่งตอบสนองสถานการณ์การใช้งานของชีวเภสัชภัณฑ์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ และอื่นๆ ได้อย่างสมบูรณ์ เมมเบรนและตัวกรองเมมเบรนของเรามีการใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านความเข้มข้น การสกัด และการแยกการกรองเบื้องต้น การกรองระดับไมโคร การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน และนาโนฟิลเตรชัน กลุ่มผลิตภัณฑ์มากมายของเรา ตั้งแต่การกรองในห้องปฏิบัติการขนาดเล็กแบบใช้ครั้งเดียวไปจนถึงระบบการกรองการผลิต การทดสอบความเป็นหมัน การหมัก การเพาะเลี้ยงเซลล์ และอื่นๆ อีกมากมาย ตอบสนองความต้องการของการทดสอบและการผลิต Guidling Technology รอคอยที่จะร่วมมือกับคุณ!