วิธีการเลือกหลอดกรองพิเศษที่เหมาะสม

หลอดกรองพิเศษที่ใช้กันทั่วไปสําหรับความเข้มข้นของโปรตีนและการเปลี่ยนบัฟเฟอร์มักใช้ในหลอดกรองพิเศษ มีรุ่นอื่น ๆ ซึ่งมีขนาดปริมาตรและหลอดกรองพิเศษที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายปริมาตรก่อนความเข้มข้นและปริมาณความเข้มข้นเป้าหมาย นํากลับมาใช้ใหม่ได้

1. เลือกหลอดกรองพิเศษที่เหมาะสมส่วนใหญ่พิจารณา MWCO และปริมาณความเข้มข้น โดยทั่วไปน้ําหนักโมเลกุลไม่ควรมากกว่า 1/3 ของน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมาย หากน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมายประมาณ 10 kd สามารถใช้หลอดกรองพิเศษที่มีน้ําหนักโมเลกุลที่เก็บไว้ 3 KD ได้

2. การกรองพิเศษที่ซื้อมาใหม่แห้ง เติมน้ํามิลลิคก่อนใช้งาน น้ําจะไหลผ่านเมมเบรนอย่างสมบูรณ์และถูกทําให้เย็นลงในอ่างน้ําแข็งหรือตู้เย็นเป็นเวลาสองสามนาที จากนั้นเทน้ําออกเพื่อเพิ่มสารละลายโปรตีน ปริมาณของสารละลายโปรตีนจะต้องไม่เกินเส้นสีขาวที่ด้านบนของหลอดทดลอง ใช้งานง่าย ก่อนที่จะเพิ่มสารละลายโปรตีนท่อกรองพิเศษจะต้องใส่ลงในน้ําแข็งเพื่อระบายความร้อนล่วงหน้า

3. ความสมดุล มวลและจุดศูนย์กลางของแรงโน้มถ่วงจะต้องสมดุล โปรดทราบว่าความเร็วและความเร่งไม่ควรเร็วเกินไปมิฉะนั้นเมมเบรนกรองพิเศษจะได้รับความเสียหายโดยตรง เริ่มการกรองแบบแรงเหวี่ยง (การระบายความร้อนด้วยแรงเหวี่ยงถึง 4 องศา) ทิศทางของไดอะแฟรมและเพลาหมุนสามารถปรับได้ตามคําแนะนํา (ในกรณีของเครื่องหมุนเหวี่ยงมุมไดอะแฟรมตั้งฉากกับเพลา) ในการใช้งานจริงความเร็วทั่วไปต่ํากว่าที่ระบุไว้ในคู่มือซึ่งอาจยืดอายุการใช้งานของท่อแรงเหวี่ยง

4. เมื่อเข้มข้นกับ 1ml ที่เหลืออยู่ [ใช้สารละลายแบรดฟอร์ดในครัวเรือน 50ul เพิ่มของเหลว 10ul เพื่อดูว่าเปลี่ยนเป็นสีน้ําเงินหรือไม่และตรวจสอบว่าหลอดกรองพิเศษรั่วไหลโปรตีนหรือไม่ หากหลอดรั่วให้เทลงในชั้นบนแล้วไหลกลับไปที่หลอดใหม่เพื่อเริ่มการกรองพิเศษ เพื่อตรวจสอบว่าหลอดทดลองรั่วหรือไม่โปรดหมุนเหวี่ยง 5 มก. 10 นาที 10 นาทีจากนั้นผ่านเรียกใช้เจลโปรตีนหรือแบรดฟอร์ด] [การวัดหยาบ] ยังคงเพิ่มสารละลายโปรตีนที่เหลือเพื่อมุ่งเน้น (ทํางานบนน้ําแข็งเพื่อป้องกันความร้อนโปรตีน) จนกว่าจะมีการเพิ่มสารละลายเข้มข้นทั้งหมด ในระหว่างการหมุนเหวี่ยงให้ใส่ใจว่าการตกตะกอนโปรตีนเกิดขึ้นและทําให้เกิดการอุดตันของหลอดหรือไม่ หากเกิดการตกตะกอนโปรดระบุสาเหตุเฉพาะของการตกตะกอนว่าความเข้มข้นของโปรตีนสูงเกินไปหรือบัฟเฟอร์ไม่เหมาะสมหรือไม่ อดีตสามารถแก้ไขได้โดยใช้หลอดกรองพิเศษหลายหลอดในเวลาเดียวกันเพื่อลดความเข้มข้นในขณะที่หลังสามารถเปลี่ยนบัฟเฟอร์ที่แตกต่างกันจนกว่าโปรตีนจะตกตะกอน

5. ขั้นตอนก่อนหน้านี้ใช้เพื่อเน้นโปรตีน หากต้องเปลี่ยนบัฟเฟอร์เมื่อสารละลายโปรตีนทั้งหมดมีความเข้มข้นประมาณ 1 มล. ค่อยๆเพิ่มบัฟเฟอร์ใหม่ (การกรองพิเศษผ่านเมมเบรนกรองพิเศษ 0.22um) จากนั้นจึงมีสมาธิอย่างต่อเนื่องประมาณ 1 มล. เป็นเวลาสามครั้งเพื่อให้ความเข้มข้นขั้นสุดท้ายขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของโปรตีนที่ต้องการซึ่งโดยปกติจะไม่เกิน 500ul หรือน้อยกว่า 200ul ตามความเข้มข้นของปริมาตรอย่างน้อย 10 ครั้งในแต่ละครั้งมันมากกว่า 1,000 เท่าของสามครั้งซึ่งสามารถบรรลุวัตถุประสงค์ในการเปลี่ยนบัฟเฟอร์

6. กําจัดโปรตีนเข้มข้นขั้นสุดท้าย ทํางานบนน้ําแข็ง ใช้ปลายปิเปตสีเหลือง (200ul) ค่อยๆสอดปลายปิเปตตามขอบจากนั้นเป่าเบา ๆ และผสมสารละลายโปรตีน ระวังอย่าสัมผัสเมมเบรนกรองพิเศษ ดูดสารละลายเข้มข้นถึง 200ul ในแต่ละครั้งจนกว่าจะถูกดูดอย่างสมบูรณ์ ไม่จําเป็นต้องแยกสารละลายเข้มข้นสุดท้ายที่ด้านล่างของหลอดทดลองมิฉะนั้นจะยากเกินไปและเมมเบรนกรองพิเศษอาจเสียหาย ในที่สุดน้ํามิลลิคจะถูกเพิ่มลงในท่อกรองพิเศษโดยไม่ต้องผ่านเมมเบรนกรองพิเศษเพื่อป้องกันการสูญเสียน้ําและการอบแห้งของเมมเบรน

7. ต่อไปนี้เป็นขั้นตอนสําหรับการรักษาท่อกรองพิเศษและนําหลอดกรองพิเศษกลับมาใช้ใหม่

8. เทน้ําลงในหลอดกรองพิเศษแล้วล้างออกด้วยน้ํามิลลิคเบา ๆ หลายครั้ง [หากมีการตกตะกอนโปรตีนที่ชัดเจนที่ด้านล่างของหลอดทดลองคุณสามารถเพิ่มน้ําก่อนแล้วเป่าออกด้วยปิเปต ระวังอย่าสัมผัสเมมเบรน ตะกอนห้อยลงมาแล้ววิ่งหนีไป คุณไม่สามารถล้างมันด้วยน้ําประปา หลังจากเพิ่มสารละลาย NaOH 0.2 เมตรให้วางไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาทีและปรับสมดุลท่อกรองพิเศษในช่วงเวลานี้ เครื่องหมุนเหวี่ยงอีก 10 นาที เทสารละลาย NaOH ที่เหลืออยู่ออกและแช่แกนฝ้ายในบีกเกอร์ (1 หรือ 2 ลิตร) น้ํามิลลิควางไว้เป็นเวลาหลายชั่วโมงแล้วแทนที่ด้วยน้ําใหม่วางไว้เป็นเวลาหลายชั่วโมงเพื่อเจือจางความเข้มข้นของ NaOH อย่างต่อเนื่อง ล้างหลอดทดลอง 50ml และคลุมด้วยน้ําประปาและล้างผนังด้านในด้วยน้ํามิลลิค

9. นําแกนหลอดทดลองที่แช่ออกเพิ่มลงในน้ํามิลลิคเต็มแล้วเติมหลอดทดลอง 50 มล. ด้วยน้ํามิลลิค ค่อยๆใส่แกนหลอดลงใน 50ml

ท่อหมุนเหวี่ยงระบายน้ําและแบ่งน้ําจากนั้นปิดฝาและเก็บที่ 4 องศาจนกว่าจะใช้ครั้งต่อไป โดยทั่วไปตามขั้นตอนข้างต้นและข้อควรระวังแต่ละหลอดจะไม่แตกภายในสามหรือสี่ปี