การอภิปรายสั้น ๆ เกี่ยวกับวิธีการเฉพาะหลายอย่างของเส้นใยกลวงในการทำให้บริสุทธิ์แบบรวม

Inclusion Bodies (IB) คืออนุภาคโปรตีนที่มีความหนาแน่นสูงและไม่ละลายน้ำซึ่งห่อหุ้มด้วยเยื่อหุ้มซึ่งเกิดขึ้นเมื่อยีนแปลกปลอมถูกแสดงออกในเซลล์โปรคาริโอต โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน Escherichia coli เมื่อสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ IB เป็นบริเวณที่มีการหักเหของแสงสูง ซึ่งแตกต่างจากส่วนประกอบอื่นๆ ในไซโตพลาสซึมอย่างเห็นได้ชัด

การสร้างร่างกายแบบรวมค่อนข้างซับซ้อน ซึ่งสัมพันธ์กับอัตราการผลิตโปรตีนในไซโตพลาสซึม ความเข้มข้นของเปปไทด์ที่สร้างขึ้นใหม่นั้นสูงและมีเวลาไม่เพียงพอที่จะพับ เพื่อสร้างมวลรวมโปรตีนอสัณฐาน ส่วนการรวมนั้นโดยพื้นฐานแล้วประกอบด้วยโปรตีน ซึ่งมากกว่า 50% เป็นผลิตภัณฑ์ที่ถูกโคลน โครงสร้างหลักของผลิตภัณฑ์เหล่านี้ถูกต้องสมบูรณ์ แต่การกำหนดค่าสามมิติไม่ถูกต้อง ดังนั้นจึงไม่มีกิจกรรมทางชีวภาพ ขนาดตัวรวมคือ 0.5-1μm ไม่ละลายในน้ำ ละลายได้ในสารเปลี่ยนสภาพเท่านั้น เช่น ยูเรีย กัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์ เป็นต้น

ใน E. coli การรวมตัวสามารถเกิดขึ้นได้ในสองตำแหน่งของเซลล์: ไซโตพลาสซึมและไซโตพลาสซึมส่วนปลาย ตำแหน่งและลักษณะของการรวมตัวในเซลล์ขึ้นอยู่กับวิธีแสดงออกของโปรตีน

การรวมตัวกันในไซโตพลาสซึมของเชื้อ E. coli โดยทั่วไปจะมีเส้นผ่านศูนย์กลางตั้งแต่ {{0}}.2 ถึง 1.5μm และโปรตีนที่แตกต่างกันก็มีเส้นผ่านศูนย์กลางต่างกัน เช่น ขนาดของอินเตอร์เฟอรอนคือ 0.811μm และขนาดของ prorennet คือ 1.281μm ในบางกรณี เส้นผ่านศูนย์กลางของส่วนที่รวมไว้จะมีขนาดใหญ่กว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของเชื้อ E. coli ซึ่งทำให้ E. coli ยื่นออกมา โดยทั่วไป เซลล์จะมีเนื้อหาที่รวมเพียงส่วนเดียวเท่านั้น

 

รวมการทำให้ร่างกายบริสุทธิ์

 

โดยทั่วไปกระบวนการทำให้ร่างกายบริสุทธิ์แบบรวมมีดังนี้:

การบดเซลล์:

เทคโนโลยีทั่วไปของการบดเซลล์คือ: การบดเนื้อเยื่อความเร็วสูง, การทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของแก้ว, การรักษาด้วยอัลตราโซนิก, วิธีการแช่แข็งละลายซ้ำ ๆ , การบำบัดทางเคมี (โดยทั่วไปใช้การบำบัดไลโซไซม์)

 

รวมการล้างร่างกาย:

Inclusion Bodies เป็นอนุภาคของแข็งที่ไม่ได้ใช้งานซึ่งเกิดจากการเกาะติดกันภายในเซลล์ของโปรตีนที่แสดงโดยแบคทีเรีย ซึ่งโดยปกติจะอยู่ในรูปแบบสัณฐานและไม่ละลายน้ำ ในตัวรวม โปรตีนเป้าหมายที่แท้จริงคิดเป็นประมาณ 50% เท่านั้น และส่วนที่เหลือประกอบด้วยไขมัน ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ กรดนิวคลีอิก และเฮเทอโรโปรตีน ซึ่งจับกับตัวรวมและส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพของโปรตีนในร่างกายที่ถูกรวมไว้ ดังนั้นการซักก่อนการเสื่อมสภาพจึงเป็นขั้นตอนที่จำเป็นมาก

นอกจากนี้ การล้างส่วนประกอบหลักที่รวมไว้มีประโยชน์ในการเพิ่มผลผลิตการพับซ้ำของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ การกำจัดสิ่งสกปรกจะช่วยลดอุปสรรคในกระบวนการเปลี่ยนสภาพ เพื่อให้สามารถพับและประกอบโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ซึ่งจะช่วยปรับปรุงกิจกรรมและการทำงานของโปรตีน‌

การซักที่ใช้โดยทั่วไปน้อยกว่า 1% ของผงซักฟอกที่เป็นกลาง เช่น Tween, Triton, Urea และ NP40 บวก EDTA และสารรีดิวซ์ 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptothanol ซ้ำหลายครั้ง เนื่องจากความสามารถในการซักของผงซักฟอกเพิ่มขึ้นด้วย การเพิ่มความแข็งแรงของไอออนิกของสารละลาย ในการล้างตัวรวมสามารถเติม NaCl เพื่อเพิ่มความแข็งแรงของไอออนิกได้

ส่วนประกอบรวมสามารถใช้เพื่อกำจัดส่วนประกอบอื่นๆ ของสารละลายสลายเซลล์โดยการปั่นแยกหรือการกรอง ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ใช้ประโยชน์จากคุณสมบัติทางกายภาพที่แตกต่างกันของส่วนประกอบรวม

 

การหมุนเหวี่ยง:

โปรตีนในร่างกายที่รวมเข้านั้นมีความหนาแน่นมากกว่าชิ้นส่วนของเซลล์ที่มีปริมาตรเท่ากัน ดังนั้นจึงสามารถแยกส่วนที่รวมไว้ออกจากส่วนที่เหลือของเซลล์ได้ด้วยวิธีการหมุนเหวี่ยง การปั่นแยกแบบต่อเนื่องเป็นการดำเนินการที่ใช้บ่อยที่สุดเพื่อให้ได้มาซึ่งส่วนประกอบรวมในการผลิตทางอุตสาหกรรม เนื่องจากความหนาแน่นของชิ้นส่วนเซลล์มีขนาดเล็กกว่าของส่วนที่รวมไว้ อัตราการตกตะกอนจึงน้อยกว่าของส่วนที่รวมไว้ การแขวนลอยและการหมุนเหวี่ยงอย่างต่อเนื่องสามารถหมุนเหวี่ยงส่วนที่รวมอยู่ส่วนใหญ่ได้ ในขณะที่ชิ้นส่วนของเซลล์จะถูกค่อยๆ เอาออก
การกรอง (การกรองการไหลในแนวสัมผัส) : เนื่องจากขนาดโมเลกุลที่แตกต่างกันของสารรวมและโปรตีนที่ละลายน้ำได้ จึงสามารถใช้วิธีการกรองได้ ซึ่งสามารถลดต้นทุนการดำเนินงานและทำให้ขยายขนาดได้ง่าย การกรองการไหลตามแนวเส้นสัมผัส (TFF) ถูกขับเคลื่อนโดยความแตกต่างของแรงดันของเมมเบรน สารและสิ่งสกปรกที่มีขนาดเล็กกว่าขนาดรูพรุนของเมมเบรนจะทะลุผ่านเมมเบรน ในขณะที่สิ่งสกปรก เช่น เซลล์ที่มีอนุภาคขนาดใหญ่จะถูกดักจับไว้ รูรับแสงของเมมเบรนโดยทั่วไปที่ใช้สำหรับการกรองการล้างคือ 0.1μm การกรองไมโครฟิลเตรชันแบบสัมผัสเส้นใยกลวงสามารถจัดการโดยตรงกับปริมาณของแข็งสูงของวัสดุของเหลว ขั้นตอนน้อยลง ใช้งานง่าย เมมเบรนสามารถใช้ซ้ำๆ ผ่านการทำความสะอาด ลดการลงทุนอุปกรณ์และต้นทุนการดำเนินงาน ซึ่งสอดคล้องกับข้อกำหนดของการผลิตอัตโนมัติแบบแยกส่วน

 

ต่อไปนี้เป็นกรณีการใช้งานสำหรับการล้างร่างกายแบบรวมโดยใช้เสาเส้นใยกลวง Guidling

เราใช้เส้นใยกลวงยาว 94 ซม.2 0.1-0.45μm เพื่อให้ของเหลวเข้มข้น 250 มล. (น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมาย 17kd) ในกระบวนการล้างทั้งหมด มีการตรวจสอบอัตราการฟื้นตัวของโปรตีนเป้าหมายและการสูญเสียฟลักซ์ของเมมเบรน

0-71นาทีคือกระบวนการทำให้เข้มข้น 71-224นาทีคือกระบวนการล้างและการกรอง ในระหว่างกระบวนการกรองระดับไมโครทั้งหมด TMP ค่อยๆ เพิ่มขึ้น ความเร็วขาเข้าของของเหลวยังคงไม่เปลี่ยนแปลง และฟลักซ์ของวัสดุโดยเฉลี่ยคือ 12LMH

ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าโปรตีนเป้าหมายถูกดักไว้อย่างสมบูรณ์ และอัตราการฟื้นตัวของโปรตีนเป้าหมายมากกว่า 90% คอลัมน์เส้นใยกลวงแบบนำมีความเสถียรและเหมาะสำหรับการใช้งานนี้

 

การสลายตัวของร่างกายรวม:

โดยทั่วไปสารที่รวมเข้าจะถูกละลายภายใต้สภาวะของยูเรียของสารที่ทำให้เสียสภาพหรือกัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์ และโปรตีนในร่างกายที่รวมเข้าที่ละลายนั้นจะถูกทำให้เสียสภาพอย่างสมบูรณ์ กล่าวคือ ยกเว้นว่าโครงสร้างปฐมภูมิและพันธะโควาเลนต์จะยังคงอยู่ พันธะไฮโดรเจนและพันธะที่ไม่ชอบน้ำทั้งหมดจะถูกทำลาย และที่ไม่ชอบน้ำ โซ่ด้านข้างเปิดออกจนหมด

ยูเรียและกัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์เป็นสารลดสภาพที่มีความเข้มข้นปานกลาง ซึ่งสามารถกำจัดออกได้ง่ายด้วยการฟอกไตและการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน ความเข้มข้นทั่วไปของยูเรีย 8-10M, กัวนิดีน ไฮโดรคลอไรด์ 6-8M การละลายยูเรียมีข้อดีของการไม่แตกตัวเป็นไอออน เป็นกลาง ต้นทุนต่ำ การกำจัดโปรตีนหลังการเปลี่ยนสภาพจะไม่ทำให้เกิดการตกตะกอนของโปรตีนจำนวนมาก และร่างกายที่รวมละลายสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้โดยวิธีโครมาโตกราฟีที่หลากหลาย ดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลาย .

 

รวมโปรตีนในร่างกาย refolding:

โปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่ละลายจะต้องพับอย่างถูกต้องเพื่อสร้างโปรตีนที่ใช้งานได้ เทคนิคสำหรับการเปลี่ยนสภาพรวมถึงการเจือจางสารละลายโปรตีนให้มีค่าใกล้เคียงเป็นกลาง การกำจัดสารเปลี่ยนสภาพ การเปลี่ยนสภาพบนคอลัมน์ และโครมาโตกราฟีแบบเจลกรอง ในหมู่พวกเขา การเจือจางสารละลายโปรตีนจนเกือบเป็นกลางและการกำจัดสารเสียสภาพเป็นวิธีการคลาสสิกทั่วไปในการเปลี่ยนสภาพใหม่ โดยเฉพาะวิธีการเปลี่ยนสภาพแบบเจือจางมีอัตราการใช้สูงสุด

การกำจัดการเสียสภาพ:

การฟอกไต: ข้อดีคือปริมาตรไม่เพิ่มขึ้น และอัตราการกำจัดสารเสียสภาพจะถูกควบคุมโดยค่อยๆ ลดความเข้มข้นของของเหลวที่ซึมเข้าไปได้ภายนอก แต่ใช้เวลานานและง่ายต่อการสร้างมวลรวมโปรตีนที่ไม่ใช้งานซึ่งไม่เหมาะสำหรับ การดำเนินการขนาดใหญ่และไม่สามารถนำไปใช้กับขนาดการผลิตได้

การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน (TFF) : ง่ายต่อการควบคุมความเร็วการฟอกไต ไม่ว่าจะในการวิจัยและพัฒนา การทดสอบนำร่อง หรือการผลิต สามารถกำจัดสารเปลี่ยนสภาพ (การเปลี่ยนแปลงของเหลว + ความเข้มข้น) ผ่านการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน (TFF)

 

รวมการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนในร่างกาย:

วิธีการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์หลังจากการคืนสภาพจะคล้ายกับวิธีการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ที่ละลายน้ำได้ กล่าวคือ โครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน, โครมาโทกราฟีแบบกรองเจล, โครมาโตกราฟีแบบอัฟฟินิตี้, การตกตะกอนของเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต เป็นต้น

สารที่ถูกรวมเข้าไม่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ ไม่จำเป็นต้องกังวลเกี่ยวกับการสูญเสียการทำงานของโปรตีน และการแสดงออกจำนวนมากจะไม่ทำให้เซลล์ตาย และเพิ่มความต้านทานต่อการโจมตีของโปรตีเอสได้สูงสุด เส้นใยกลวงของ Jiuling สามารถนำไปใช้ได้อย่างยืดหยุ่นในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นปลายน้ำของตัวรวม ในขั้นตอนการล้างร่างกายแบบรวม ประสิทธิภาพที่ยอดเยี่ยมเมื่อเทียบกับการล้างแบบแรงเหวี่ยง การใช้เส้นใยกลวงไมโครฟิลเตรชันเทคโนโลยีเก้ายุคสำหรับการล้างการกรองการไหลแบบสัมผัสสามารถลดระยะเวลาในกระบวนการได้อย่างมาก และอัตราการฟื้นตัวโดยทั่วไปสามารถเข้าถึงได้มากกว่า 90% เส้นใยกลวง Jiuling ยังสามารถนำมาใช้ในขั้นตอนการคืนสภาพโปรตีนของส่วนที่รวมอยู่ด้วย ความขุ่นของของเหลวป้อนอาหารที่ถูกกรองด้วยเส้นใยกลวงแบบไมโครฟิลเตรชันจะลดลงอย่างมาก และอัตราการคืนโปรตีนจะสูง การใช้เส้นใยกลวงแบบอัลตราฟิลเตรชันไม่เพียงแต่สามารถกำจัดสารเสียสภาพเท่านั้น แต่ยังช่วยลดเวลาในการโหลดตัวอย่างโครมาโตกราฟี เพื่อประหยัดเวลา ลดปริมาณของฟิลเลอร์ และลดต้นทุนการผลิต อัตราการคืนสภาพของเส้นใยกลวงแบบไมโครฟิลเตรชัน/อัลตราฟิลเตรชันจะแตกต่างกันไปตามวัสดุที่แตกต่างกัน และอัตราการคืนสภาพโดยทั่วไปสามารถสูงถึง 90-95%

Guidling Technology ยินดีต้อนรับคุณในการขอชุดทดสอบสำหรับการตรวจสอบที่เกี่ยวข้อง

 

เกี่ยวกับ กิดลิ่ง

Guidling Technology เป็นองค์กรเทคโนโลยีขั้นสูงระดับประเทศที่มุ่งเน้นด้านเภสัชภัณฑ์ชีวภาพ การเพาะเลี้ยงเซลล์ การทำให้บริสุทธิ์และความเข้มข้นของชีวเวชศาสตร์ การวินิจฉัยโรค และของเหลวทางอุตสาหกรรม เราประสบความสำเร็จในการพัฒนาอุปกรณ์กรองแบบแรงเหวี่ยง ตลับกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันและไมโครฟิลเตรชัน ตัวกรองไวรัส ระบบ TFF ตัวกรองเชิงลึก เส้นใยกลวง ฯลฯ ซึ่งตอบสนองสถานการณ์การใช้งานของชีวเภสัชภัณฑ์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ และอื่นๆ ได้อย่างสมบูรณ์ เมมเบรนและตัวกรองเมมเบรนของเรามีการใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านความเข้มข้น การสกัด และการแยกการกรองเบื้องต้น การกรองระดับไมโคร การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน และนาโนฟิลเตรชัน กลุ่มผลิตภัณฑ์มากมายของเรา ตั้งแต่การกรองในห้องปฏิบัติการขนาดเล็กแบบใช้ครั้งเดียวไปจนถึงระบบการกรองการผลิต การทดสอบความปลอดเชื้อ การหมัก การเพาะเลี้ยงเซลล์ และอื่นๆ อีกมากมาย ตอบสนองความต้องการของการทดสอบและการผลิต Guidling Technology รอคอยที่จะร่วมมือกับคุณ!