การประยุกต์ใช้ของUlการกรองในEการสกัดของNโดยธรรมชาติCคอลลาเจน

 

Ⅰ.คอลลาเจนคืออะไร

คอลลาเจนเป็นโพลีเมอร์ชีวภาพ ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักในเนื้อเยื่อเกี่ยวพันของสัตว์ และยังเป็นโปรตีนเชิงฟังก์ชันที่มีมากที่สุดและกระจายอย่างกว้างขวางในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม คิดเป็น 25%–30% ของโปรตีนทั้งหมด และมากถึงมากกว่า 80% ในบางส่วน สิ่งมีชีวิต มีบทบาทในการจับเนื้อเยื่อในเซลล์สัตว์

จากการวัดพบว่า ผู้ใหญ่มีคอลลาเจนในร่างกายประมาณ 3 กิโลกรัม ซึ่งส่วนใหญ่พบในผิวหนัง กระดูก ดวงตา ฟัน เส้นเอ็น อวัยวะภายใน (รวมถึงหัวใจ กระเพาะอาหาร ลำไส้ และหลอดเลือด) และส่วนอื่นๆ ของร่างกายมนุษย์ หน้าที่ของมันคือการรักษาสัณฐานวิทยาและโครงสร้างของผิวหนังและอวัยวะต่างๆ และยังเป็นวัตถุดิบสำคัญในการซ่อมแซมเนื้อเยื่อที่เสียหายอีกด้วย

ครั้งที่สอง การสกัดคอลลาเจนจากเกล็ดปลาคาร์ปหญ้าโดยการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน

1. วัสดุและวิธีการ

1.1 ตัวอย่างทดสอบ

สารสกัดจากคอลลาเจนแบบน้ำ

1.2 วิธีทดสอบ

1.2.1 กระบวนการอัลตราฟิลเตรชั่น

1.2.2 การกำหนดกระบวนการกรองเบื้องต้น

ในการทดสอบนี้ กระบวนการกรองล่วงหน้าที่เหมาะสมที่สุดจะถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์เปรียบเทียบระหว่างวิธีการกรองแบบสุญญากาศและวิธีการกรองระดับไมโคร วิธีการทดสอบเฉพาะมีดังนี้:

extract สารสกัดน้ำคอลลาเจนดิบถูกกรองโดยวิธีการกรองสูญญากาศด้วยกระดาษกรองเพื่อกำจัดอนุภาคแขวนลอยและสิ่งสกปรกในสารสกัดที่เป็นน้ำ

2) สารสกัดน้ำคอลลาเจนแบบหยาบจะถูกกรองด้วยเมมเบรนกรองขนาดเล็ก 0.2 μm เพื่อกำจัดสารที่ไม่ละลายน้ำ สิ่งเจือปน ฯลฯ ในสารสกัดที่เป็นน้ำ

1.2.3 การเลือกขนาดรูพรุนของเมมเบรนแบบอัลตราฟิลเตรชั่น

ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ ขนาดรูพรุนของเมมเบรนกรองละเอียดคือ 100 kDa

1.2.4 การทดลองปัจจัยเดียวของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน

สารสกัดที่เป็นน้ำของคอลลาเจนดิบได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคโนโลยีการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน ศึกษาการทดลองปัจจัยเดียวเกี่ยวกับผลกระทบของแรงดันใช้งาน อุณหภูมิในการทำงาน และ pH ต่อการกักเก็บคอลลาเจน หลังจากเริ่มใช้อุปกรณ์อัลตราฟิลเตรชั่นเป็นระยะเวลาหนึ่ง ให้ศึกษาผลของปัจจัยต่างๆ ที่มีต่ออัตราการกักเก็บคอลลาเจน

1.2.5 สูตรคำนวณ

2. ผลลัพธ์และการวิเคราะห์

2.1 การวิเคราะห์กระบวนการกรองล่วงหน้า

ดูตารางด้านล่างสำหรับผลการเปรียบเทียบวิธีการกรองแบบสุญญากาศและวิธีการกรองแบบไมโคร

วิธีการกรอง	ความเข้มข้นของสารละลายก่อนการกรอง/(กรัม/ลิตร)	ความเข้มข้นของสารละลายหลังจากการกรอง/(กรัม/ลิตร)	ปรากฏการณ์ทางประสาทสัมผัส
วิธีการกรองแบบสุญญากาศ	0.45	0.35	สารละลายจะชัดเจนเมื่อสิ้นสุดการกรอง แต่จะขุ่นหลังจากปล่อยทิ้งไว้เป็นระยะเวลาหนึ่ง
วิธีการกรองแบบไมโคร	0.45	0.42	สารละลายมีความชัดเจนเมื่อสิ้นสุดการกรองและยังคงชัดเจนหลังจากปล่อยทิ้งไว้เป็นระยะเวลาหนึ่ง

 

จากตารางจะเห็นได้ว่าทั้งวิธีการกรองแบบสุญญากาศและวิธีการกรองแบบไมโครสามารถกำจัดสิ่งสกปรกและของแข็งที่ไม่ละลายน้ำในสารละลายได้ แต่วิธีการกรองแบบไมโครมีผลในการป้องกันโปรตีนที่ดีกว่า กล่าวคือ การสูญเสียไม่มีนัยสำคัญ และ วิธีการกรองแบบสุญญากาศมีแนวโน้มที่จะทำให้เกิดการสูญเสียโปรตีน นอกจากนี้ สารกรองจะมีขุ่นหลังจากถูกกรองด้วยสุญญากาศเป็นระยะเวลาหนึ่ง ในขณะที่การกรองระดับไมโครยังคงมีความชัดเจนและโปร่งใส ดังนั้นจึงเลือกการกรองระดับไมโครเป็นกระบวนการปรับสภาพของการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน

2.2 การทดสอบปัจจัยเดียวของกระบวนการอัลตราฟิลเตรชัน

2.2.1 ผลกระทบของแรงดันการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันต่ออัตราการกักเก็บ

ภายใต้สภาวะอุณหภูมิ 40 องศา และ pH 9.0 ให้ศึกษาผลกระทบของความดันการกรองอัลตราฟิลเตรชันต่างๆ (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0.11MPa, 0.13MPa และ 0.15MPa) กับอัตราการกักเก็บโปรตีน ผลลัพธ์จะแสดงในรูปด้านล่าง

 

ดังที่เห็นได้จากรูปด้านบน เมื่อความดันใช้งานเพิ่มขึ้น อัตราการสกัดกั้นของโปรตีนจึงค่อยๆ ลดลง ที่ {{0}}.07MPa อัตราการกักเก็บโปรตีนคือ 96.53% เมื่อความดันใช้งานคือ 0.15MPa อัตราการกักเก็บโปรตีนคือ 84.38% เนื่องจากการแยกสารด้วยการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันนั้นขับเคลื่อนด้วยความแตกต่างของแรงดัน ในช่วงความดันใช้งานต่ำนั้น สารโมเลกุลขนาดเล็กสามารถผ่านเมมเบรนได้อย่างรวดเร็ว แต่สารโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถดักจับโดยเมมเบรนกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันและสะสมอยู่บนพื้นผิวของเมมเบรน และในขณะนี้ พื้นผิวของเมมเบรนและน้ำ แยกความแตกต่างความเข้มข้นของแบบฟอร์มเพื่อทำให้เกิดความต้านทานโพลาไรเซชันความแตกต่างความเข้มข้น อย่างไรก็ตามด้วยความดันที่เพิ่มขึ้น ความต้านทานโพลาไรเซชันของความเข้มข้นจะค่อยๆ เพิ่มขึ้น และความแตกต่างของความเข้มข้นระหว่างพื้นผิวเมมเบรนและสารสกัดที่เป็นน้ำจะถึงจุดสมดุล เมื่อความดันเกินสมดุลนี้ ชั้นเจลสามารถเขียนได้บนพื้นผิวเมมเบรน (ซึ่งสอดคล้องกับทฤษฎีโพลาไรเซชันของความเข้มข้นและชั้นเจลที่เกิดขึ้นระหว่างการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน) ความดันยังคงเพิ่มขึ้น และความหนาของชั้นเจลเพิ่มขึ้น และโปรตีนที่เหลืออยู่บนพื้นผิวของเมมเบรนเพิ่มขึ้น ส่งผลให้อัตราการกักเก็บต่ำ เพื่อให้มั่นใจถึงผลการแยกตัวของเมมเบรน พารามิเตอร์แรงดันใช้งานที่เหมาะสมที่สุดคือ 0.07MPa

2.2.2 ผลของอุณหภูมิต่ออัตราการกักเก็บโปรตีน

ภายใต้สภาวะความดัน {{0}.11MPa, pH 9.0 ให้ศึกษาผลกระทบของอุณหภูมิที่แตกต่างกัน (25 องศา , 30 องศา , 35 องศา , 40 องศา และ 45 องศา ) ต่อการกักเก็บโปรตีน ผลลัพธ์จะแสดงในรูปด้านล่าง

 

ดังแสดงในรูปด้านบน เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้น อัตราการเก็บรักษาของเมมเบรนอัลตราฟิลเตรชันจะเพิ่มขึ้นทีละน้อย และถึงสูงสุดที่ 45 องศา โดยมีอัตราการกักเก็บอยู่ที่ 97.01% เนื่องจากความหนืดของคอลลาเจนมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับอุณหภูมิ เมื่ออุณหภูมิลดลง ความหนืดของคอลลาเจนจะมีมากขึ้น ส่งผลให้คอลลาเจนเกิดความต้านทานบนพื้นผิวของเมมเบรนได้ง่าย ส่งผลให้อัตราการกักเก็บต่ำ เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้น ความหนืดของคอลลาเจนจะลดลง และปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลคอลลาเจนจะลดลง ดังนั้นอัตราการถ่ายโอนมวลจึงเพิ่มขึ้น และโพลาไรเซชันของความเข้มข้นจะลดลง จึงทำให้อัตราการกักเก็บเพิ่มขึ้น อีกเหตุผลหนึ่งที่ทำให้อัตราการกักเก็บเพิ่มขึ้นก็คือ อุณหภูมิเพิ่มขึ้น และความสามารถในการละลายของคอลลาเจนก็เพิ่มขึ้นตามไปด้วย และปรากฏการณ์คอลลาเจนที่ปิดกั้นเยื่อหุ้มเซลล์ก็ลดลง ดังนั้นอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชั่นคือ 45 องศา

2.2.3 ผลของ pH ต่อการกักเก็บโปรตีน

ภายใต้สภาวะความดัน {{0}.11MPa และอุณหภูมิ 40 องศา ให้ศึกษาผลกระทบของสภาวะ pH ต่างๆ ได้แก่ pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 และ pH=10.0 ตามอัตราการคงอยู่ ผลลัพธ์จะแสดงในรูปด้านล่าง

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7 อัตราการเก็บรักษาจะเพิ่มขึ้นทีละน้อยตามค่า pH ที่เพิ่มขึ้น เนื่องจากเมมเบรนแบบอัลตราฟิลเตรชันคือเมมเบรนเมเปิ้ลโพลีเอเทอร์ที่มีประจุลบ คอลลาเจนที่มีประจุลบภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง โมเลกุลคอลลาเจนที่มีประจุลบ และเมมเบรนแบบอัลตราฟิลเตรชันที่มีประจุเท่ากันจะเกิดสถานะที่ไม่เกิดร่วมกัน ดังนั้นโมเลกุลของคอลลาเจนจึงไม่สามารถอยู่บนพื้นผิวได้ง่าย ของเมมเบรน ไม่ใช่เรื่องง่ายที่จะปิดกั้นเมมเบรน ดังนั้นค่า pH ที่เหมาะสมของการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันคือ 8-10

2.3 การเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการกรองอัลตราไวโอเลตและการตรวจสอบผลลัพธ์

การวิเคราะห์โดยผู้เชี่ยวชาญด้านการออกแบบ8.05 ซอฟต์แวร์แสดงให้เห็นว่าพารามิเตอร์กระบวนการที่เหมาะสมที่สุดมีดังนี้: ความดันใช้งาน 0.14MPa อุณหภูมิในการทำงาน 40.98 องศา และ pH ของสารละลาย=9.43 ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ อัตราการเก็บรักษาอยู่ที่ 92.551% เมื่อพิจารณาถึงความสามารถในการทำงานของพารามิเตอร์จริง แรงดันใช้งานคือ 0.14MPa อุณหภูมิในการทำงานคือ 40 องศา และค่า pH ของของเหลวป้อนคือ 9.50 ภายใต้สภาวะการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน การตรวจสอบเชิงทดลองเริ่มต้นขึ้นหลังจากที่ระบบของอุปกรณ์อัลตราฟิลเตรชันเริ่มมีเสถียรภาพ ผลลัพธ์อัตราการคงผู้ใช้ที่ได้รับคือ (92.61 0.1)% (n=3) โดยพื้นฐานแล้วค่าที่ทำนายของสมการจะคล้ายกับค่าที่วัดได้ ซึ่งบ่งชี้ว่าผลลัพธ์ของพารามิเตอร์ที่มีเงื่อนไขที่คาดการณ์นั้นสอดคล้องกับผลลัพธ์ที่มีเงื่อนไขจริง

2.4 ผลการวิเคราะห์อิเล็กโทรโฟเรซิส

คอลลาเจนบริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์โดยอิเล็กโทรโฟเรซิส SDS-PAGE และผลลัพธ์จะแสดงดังรูปด้านล่าง

ดังแสดงในรูปด้านบน เลนที่ 1 คือคอลลาเจนบริสุทธิ์ในการทดลองนี้ และเลนที่ 2 คือตัวอย่างคอลลาเจนมาตรฐานของเอ็นน่อง จะเห็นได้จากการตรวจด้วยไฟฟ้าด้วยไฟฟ้า SDS-PAGE ว่าโปรตีนคอลลาเจนที่นำเสนอในการทดลองนี้สามารถระบุได้ว่าเป็นคอลลาเจน แต่ขอบเขตของสายโซ่เปปไทด์ a1 และสายเปปไทด์ a2 นั้นไม่ชัดเจน จากอิเล็กโตรโฟเรซิสเห็นได้ชัดเจนว่าไม่มีแถบโปรตีนอื่นใด สรุปได้ว่า คอลลาเจนบริสุทธิ์มีความบริสุทธิ์สูง